碳青霉烯酶OXA-72在畢赤酵母中的表達純化及其性質研究.pdf

1、目的： 以我們從臨床分離的我國第一株分泌碳青霉烯酶OXA-72的鮑曼氏不動桿菌菌株為模板，在畢赤酵母表達系統(tǒng)中重組表達并分離純化碳青霉烯酶OXA-72，并測定其等電點，為進一步研究碳青霉烯酶OXA-72的結構、功能和性質奠定基礎。 方法： 使用E-test藥敏紙條檢測12種抗生素對鮑曼氏不動桿菌菌株40的MIC。 提取鮑曼氏不動桿菌菌株40的總DNA，以之為模板，用目的引物P1、P2進行PCR，擴增產物通

2、過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。 PCR擴增產物經EcoRI和KpnI雙酶切、回收，連接雙酶切后的pGAPZαA，得到重組質粒pGAPZ-oxa72，轉化E coli DH5a，得到E coliDH5a(pGAPZ-oxa72)，擴增后提取重組質粒pGAPZ-oxa72，以之為模板，用載體引物進行PCR，擴增產物通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測；并對重組質粒進行雙酶切和測序鑒定。 用AvrII酶切重組質粒pGAPZ-oxa72使之線

3、性化，然后電擊轉化入GS115酵母細胞中，利用含Zeocin的YPDS平板篩選陽性轉化子。同時以AvrII線性化的不含oxa-72的空質粒pGAPZaA電轉化GS115作對照。 提取酵母基因組DNlA，以之為模板，用目的引物和載體引物分別進行PCR，以驗證陽性克隆GS115(pGAPZ-oxa72)和GS115(pGAPZαA)。采用超聲法破碎培養(yǎng)72h的陽性克隆GS115(pGAPZ-oxa72)和GS115(pGAPZαA)

4、的菌體，然后離心取上清，用His tag antibody做western blotanalysis。 用含有高濃度Zeocin的YPD平板二次劃線篩選陽性克隆，挑取單克隆至5ml培養(yǎng)液中，30℃、220rpm震蕩培養(yǎng)72h，離心，將上清轉移至新EP管中，用等體積YPD培養(yǎng)基重懸菌體，分別向菌體溶液和上清中滴加一滴頭孢硝噻吩，觀察溶液顏色的變化，同時以GS115(pGAPZaA)菌株和GS115菌株做對照。 采用鎳瓊脂糖

5、凝膠柱色譜分離重組蛋白。緩沖液平衡鎳柱后將20ml細胞破碎液上樣，再用緩沖液洗柱后，分別用50mM和200mM咪唑緩沖液進行階段洗脫，收集各階段洗脫峰，SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色檢測重組蛋白的分子量大小和純度。 委托北京蛋白質組研究中心對純化所得的OXA-72蛋白凍干粉進行等電聚焦電泳，以測定重組蛋白質的等電點。 結果： 菌株40的亞胺培南和美羅培南的最低抑菌濃度(MIC)均為32μg/ml，此外還對頭

6、孢噻吩、頭孢哌酮、羥氨芐青霉素和羥氨芐青霉素．棒酸(2/1)耐藥。 1％瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR擴增得到約843bp的oxa-72基因，且未見非特異性擴增條帶；用載體引物進行PCR擴增pGAPZ-oxa72，得到的片段長度約為1340bp；雙酶切pGAPZ-oxa72得到約840bp和約3kb的兩片段，與預期一致；用載體引物對pGAPZ-oxa72測序，將測序序列blast顯示克隆的oxa-72基因與Genbank中oxa-72

7、基因序列(GenBank accessionnumbers AY739646)相似性為100％，完全一致；這表明oxa-72的酵母表達載體構建成功。 挑取含有Zeocin的YPDS平板上的陽性轉化子并擴增，提取其DNA為模板，用目的引物和載體引物分別做PCR，分別得到約843bp和1340bp者為陽性克隆GS115(pGAPZ-oxa72)以不含oxa-72的空質粒pGAPZaA電轉化GS115所得到的陽性克隆GS115(pGA

8、PZaA)用目的引物擴增時無特異性產物，只能用載體引物擴增出約540bp的片段。用培養(yǎng)72h的GS115(pGAPZ-oxa72)的蛋白提取物做Western blot可以得到單一的特異條帶，這說明重組蛋白能特異地與抗His-Tag抗體結合，而對照GS115(pGAPZaA)和GS115則沒有得到特異條帶。 分別滴加頭孢硝噻吩后，含有oxa-72基因的陽性克隆GS115(pGAPZ-oxa72)的菌體懸液和上清均可在十分鐘內由淡

9、黃色變?yōu)榧t色，而不含oxa-72基因的陽性克隆GS115(pGAPZaA)及未轉化的GS115菌株的菌體懸液和上清均不變色，觀察時間延長至半小時以上亦無改變，這表明，菌體和上清中均有OXA-72蛋白的表達，且所表達的OXA-72碳青霉烯酶均有活性。 鎳柱純化表達產物，得到的蛋白純度為95％，純化回收率達40％。 純化所得重組蛋白的等電點為6.37。 結論： 成功構建了OXA-72的表達載體，在畢赤酵母中成