沙城產(chǎn)區(qū)龍眼葡萄相關(guān)酵母菌生物多樣性研究及優(yōu)良酵母菌種的篩選.pdf

1、葡萄酒的發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的微生物變化過(guò)程，酵母菌是發(fā)酵過(guò)程的主導(dǎo)。龍眼葡萄是我國(guó)特有的葡萄品種，本研究從沙城葡萄酒產(chǎn)區(qū)龍眼葡萄園生態(tài)環(huán)境和酒廠環(huán)境中分離酵母菌種，利用傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)的方法將分離得到的酵母菌株進(jìn)行初步分類(lèi)，再在形態(tài)分類(lèi)的基礎(chǔ)上利用分子手段進(jìn)行區(qū)分和鑒定，最后對(duì)篩選出的釀酒酵母菌株進(jìn)行葡萄酒釀造試驗(yàn)，初步篩選出適合龍眼干白葡萄酒釀造的本地酵母菌株。本研究對(duì)葡萄酒產(chǎn)區(qū)酵母種質(zhì)資源的探明以及篩選優(yōu)良的本地酵母菌株具有重要意義。<

2、br>　　 首先，酵母菌株的分離和初步形態(tài)區(qū)分：本研究于2008～2009年從河北沙城釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)的懷來(lái)縣沙城鎮(zhèn)沙營(yíng)、夾河和東水泉三個(gè)自然村的龍眼葡萄園，沙城長(zhǎng)城葡萄酒有限公司釀酒車(chē)間，采集葡萄園土壤樣品、葡萄果表樣品、葡萄鮮汁樣品、自然發(fā)酵過(guò)程葡萄汁樣品和設(shè)備表面樣品共計(jì)184份。從不同來(lái)源的樣品中共分離、保藏酵母960株，通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)區(qū)分的方法，利用WL培養(yǎng)基對(duì)這960株酵母進(jìn)行初步形態(tài)鑒定，結(jié)果區(qū)分為16個(gè)不同培養(yǎng)類(lèi)型的酵母。其

3、中，葡萄園土壤中的酵母種類(lèi)最為豐富，有9類(lèi)；自然發(fā)酵過(guò)程其次，有8類(lèi)；而設(shè)備表面只分離到3類(lèi)不同形態(tài)的酵母。
　　 其次，利用分子生物學(xué)的方法對(duì)從不同來(lái)源分離得到的不同培養(yǎng)形態(tài)的酵母進(jìn)行區(qū)分和鑒定：本研究采用兩種分子手段區(qū)分酵母菌株，分別是核糖體5.8S-ITS區(qū)域PCR-RFLP的方法和核糖體26S D1/D2 區(qū)域PCR-RFLP的方法。利用核糖體5.8S-ITS區(qū)域的序列分析方法將酵母鑒定到種的水平。結(jié)果顯示：SDS熱裂解

4、法(菌落PCR提取擴(kuò)增模板)是一種快速、簡(jiǎn)單、最適合本實(shí)驗(yàn)的酵母DNA提取方法。利用5.8S-ITS區(qū)域的RFLP的方法，結(jié)果顯示在連續(xù)兩個(gè)釀酒年份沙城葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離得到的酵母共獲得16類(lèi)酶切圖譜類(lèi)型；利用序列分析的方法將9類(lèi)酵母鑒定到種的水平，分別是梅奇氏酵母(Metschnikowia spp.)；釀酒酵母(Saccharomyces bayanus×Saccharomyces cerevisiae)；伊薩酵母(Issatchenk

5、ia occidentalis)；假絲酵母(Candida zemplinina)；東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)；熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)；膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefacien)；淺黃隱球酵母(Cryptocococcus flavescens)；有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)。研究發(fā)現(xiàn)不同釀酒年份，不同來(lái)源的樣品分離得到的酵母

6、，其生物多樣性組成各不相同，但最常見(jiàn)的是釀酒酵母(Saccharomyces bayanus×Saccharomyces cerevisiae)。利用核糖體26S D1/D2區(qū)域的RFLP的方法能將2008釀酒年份分離得到的10種不同形態(tài)的酵母在分子水平上區(qū)分為10類(lèi)，這種方法對(duì)于酵母菌種的區(qū)分鑒定非常有效。
　　 最后，本研究利用篩選得到的兩株釀酒酵母菌株DHS-1和CZ-1進(jìn)行葡萄酒釀造試驗(yàn)，利用商用活性干酵母CY3079作

7、為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，結(jié)果顯示，接種CZ-1酵母進(jìn)行發(fā)酵，其發(fā)酵速率最快，但降糖速度較慢；發(fā)酵結(jié)束后原酒的酸度最高；而酵母菌株DHS-1在釀造特性上體現(xiàn)出來(lái)更快的降糖速度，用其釀制的龍眼葡萄原酒總酸的含量最低，殘?zhí)橇康陀? g/l，且口感協(xié)調(diào)，初步認(rèn)為DHS-1是適合龍眼葡萄酒釀造的本地酵母菌株。對(duì)于紫北賽、煙73、赤霞珠這3種紅葡萄品種，利用前兩種葡萄接種DHS-1在發(fā)酵過(guò)程中表現(xiàn)出的降糖速度、可溶性固形物降低速度、葡萄原酒的酸度以及色度這些指

8、標(biāo)都要優(yōu)于接種安琪酵母，而赤霞珠葡萄則相反，說(shuō)明DHS-1同樣適合紫北賽和煙73紅葡萄酒的釀造。
　　 總之，本研究利用傳統(tǒng)形態(tài)區(qū)分的方法，將分離得到的酵母菌株分為16類(lèi)，顯示了沙城產(chǎn)區(qū)龍眼葡萄相關(guān)酵母菌群組成的多樣性。利用分子手段將這16類(lèi)酵母在分子水平上進(jìn)一步區(qū)分，并且將其中9種酵母鑒定到種的水平，顯示了產(chǎn)區(qū)酵母的基因多樣性。通過(guò)葡萄酒釀造試驗(yàn)，初步篩選出了適合龍眼葡萄酒釀造的本地酵母菌株DHS-1。同時(shí)，這種酵母也是適合紫