荔枝TPEC高頻率體胚發(fā)生及荔枝與龍眼原生質(zhì)體融合研究.pdf

1、本研究以荔枝轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體再生的胚性愈傷組織(TPEC)細(xì)胞系為材料，優(yōu)化荔枝TPEC長(zhǎng)期繼代保持的方法和條件；進(jìn)行TPEC體胚發(fā)生的同步化調(diào)控，建立其高頻率體胚發(fā)生的技術(shù)體系：通過(guò)POD和淀粉酶活性的測(cè)定，POD、EST同工酶酶譜變化分析，以及淀粉和可溶性總糖含量等生理指標(biāo)測(cè)定，結(jié)合石蠟切片和透射電鏡觀察不同形態(tài)體胚的顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)等研究，進(jìn)一步探討荔枝TPEC體胚發(fā)生的機(jī)理；以荔枝TPEC細(xì)胞系中的Q81.535懸浮細(xì)胞為材料，

2、優(yōu)化荔枝TPEC高頻率原生質(zhì)體再生條件；并以荔枝TPEC細(xì)胞系中的Q81.535懸浮細(xì)胞和龍眼松散型胚性愈傷組織LC2為材料，采用PA-4000電融合儀進(jìn)行荔枝與龍眼的原生質(zhì)體融合的初步研究。主要研究結(jié)果如下： 1.荔枝TPEC長(zhǎng)期繼代保持條件的優(yōu)化與體胚發(fā)生的同步化調(diào)控。采用在MS附加1mg·L-12,4-D與附加1 mg·L-12,4-D+50 mg·L-1潮霉素(Hygromyein B)的2種培養(yǎng)基交替繼代培養(yǎng)，20天繼

3、代一次，荔枝TPEC細(xì)胞系交替繼代培養(yǎng)了2年，保持了其抗性和體胚發(fā)生能力，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且其體胚發(fā)生能力均高于對(duì)照。采用附加0.3 mg·L-12,4-D、20 g·L-1和1 mg·L-12,4-D、50g·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基對(duì)荔枝TPEC進(jìn)行同步化調(diào)控，經(jīng)在附加5 mg·L-1ZT高糖(50g·L-1)高瓊脂(10 g·L-1)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行體胚分化，體胚大小基本趨于一致，同步化程度高，荔枝TPEC體胚發(fā)生的頻率得到了很大的

4、提高，并且在附加1 mg·L-12,4-D、50g·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基的同步化調(diào)控的效果優(yōu)于附加0.3 mg·L-12,4-D、20 g·L-1蔗糖。 2.激素、滲透壓調(diào)節(jié)物、天然附加物等對(duì)荔枝TPEC體胚發(fā)生及其成熟的影響。不同濃度的細(xì)胞分裂素(ZT、KT、6-BA)對(duì)荔枝TPEC體胚發(fā)生的影響存在差異，其對(duì)體胚發(fā)生所起作用的順序?yàn)閆T>KT>6-BA。并確定荔枝體胚高頻率發(fā)生的適宜培養(yǎng)基為附加3.0 mg·L-1ZT、附

5、加50 g·L-1蔗糖、10 mg·L-1瓊脂、100 mg·L-1肌醇：pH為5.8的MS培養(yǎng)基。在此培養(yǎng)基上體胚發(fā)生頻率為100％，早期白色正常胚的比例達(dá)82％，個(gè)體較大，多為正常子葉胚：椰乳和龍眼汁對(duì)荔枝TPEC體胚的成熟有促進(jìn)作用，其體胚正常成熟率分別為48.3％和45.6％；而ABA、BA、PEG均不利于荔枝TPEC體胚成熟，其體胚正常成熟率最高的達(dá)17.4％。 3.荔枝TPEC體胚發(fā)生機(jī)理的研究。①荔枝TPEC長(zhǎng)期繼

6、代保持、體胚發(fā)生及其成熟過(guò)程中相關(guān)酶活性的研究。荔枝TPEC長(zhǎng)期繼代、體胚發(fā)生及其成熟過(guò)程中，POD活性總體呈下降趨勢(shì)，分別在球形胚階段和在成熟培養(yǎng)15天時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)峰值，且球形胚的POD活性最強(qiáng)；淀粉酶活性較低，α-淀粉酶與β-淀粉酶活性變化總體變化趨勢(shì)都呈雙峰型，但其峰值出現(xiàn)的時(shí)間不同；在不同細(xì)胞系之間，荔枝TPEC的4個(gè)細(xì)胞系的POD活性均高于對(duì)照；α-淀粉酶的活性低于對(duì)照，而β淀粉酶的活性高于對(duì)照。早期白色子葉胚與玻璃化胚、正常成

7、熟與提早生根的成熟體胚之間POD和淀粉酶的活性也存在差異。②采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)荔枝TPEC繼代、體胚發(fā)生及其成熟過(guò)程中POD與EST同工酶酶譜進(jìn)行分析。荔枝TPEC不同細(xì)胞系之間、不同形態(tài)以及不同成熟時(shí)間的體胚的POD同工酶譜帶既有酶帶強(qiáng)弱的差異，又有帶數(shù)的增減：EST同工酶具有穩(wěn)定性，不同細(xì)胞系之間EST同工酶酶譜只有強(qiáng)弱的差異，沒(méi)有譜帶的變化，而在體胚發(fā)生及其成熟過(guò)程中EST同工酶出現(xiàn)兩條新的譜帶，其變化是相對(duì)穩(wěn)定的，酯酶同工

8、酶譜帶條數(shù)不存在差異，只是表達(dá)量上的不同。③研究了荔枝TPEC體胚發(fā)生及其成熟過(guò)程中總糖和淀粉含量的變化。荔枝TPEC體胚發(fā)生和成熟過(guò)程中可溶性總糖含量的變化呈雙峰型變化，峰值分別出現(xiàn)在球形胚階段和成熟30 d；淀粉含量的變化趨勢(shì)呈三峰型，峰值分別在球形胚、成熟培養(yǎng)15 d和60 d；早期白色子葉胚和玻璃化胚之間、提早生根與正常的成熟體胚之間可溶性總糖和淀粉的含量均存在差異。④采用石蠟和超薄切片的方法對(duì)荔枝TPEC體胚的顯微和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)

9、行了研究。不同階段、不同形態(tài)體胚的顯微和超微結(jié)構(gòu)均存在差異。荔枝TPEC早期白色子葉胚和正常成熟的體胚的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的特征是細(xì)胞形狀比較規(guī)則，大小均勻，細(xì)胞內(nèi)含物豐富；玻璃化子葉胚和提早生根的成熟胚細(xì)胞較大，細(xì)胞壁較薄，液泡很大，細(xì)胞核小，有核仁存在，核質(zhì)較濃；細(xì)胞內(nèi)含物較少。 4.荔枝與龍眼原生質(zhì)體融合及其產(chǎn)物初步培養(yǎng)研究。荔枝TPEC細(xì)胞系Q81.535懸浮細(xì)胞系原生質(zhì)體分離的適宜條件是：在不含潮霉素的交替繼代培養(yǎng)基上懸浮培

10、養(yǎng)6-8代的第5 d的懸浮細(xì)胞，用含纖維素和離析酶各1％的CPW-13M酶解液，在黑暗、25±2℃條件下，采用連續(xù)振蕩(30-40 r-min-1)酶解10 h。在此條件下，荔枝TPEC原生質(zhì)體產(chǎn)量最高達(dá)10.8×107個(gè)/g，活力最高達(dá)95.3％；以改良KM8P培養(yǎng)基中附加1.0mg·L-12,4-D、0.2mg·L-1NAA、0.5 mg·L-1BA、0.5 mg·L-1KT、50 mL·L-1椰汁、250 mg·L-1谷氨酰胺、0

11、.45 M葡萄糖和0.1 M蔗糖為培養(yǎng)基，采用海藻酸鈉鹽包埋懸浮方式黑暗培養(yǎng)，使得高頻率原生質(zhì)體再生；以荔枝TPEC中細(xì)胞系Q81.535懸浮細(xì)胞和龍眼松散型胚性愈傷組織LC2為材料，采用PA-4000電融合儀進(jìn)行荔枝龍眼原生質(zhì)體融合的適宜條件是當(dāng)原生質(zhì)體密度為5×105個(gè)·mL-1時(shí)，選用交流電場(chǎng)的頻率為1.0 Mhz、交變電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)為50 V·cm-1，作用時(shí)間為60 s，直流脈沖強(qiáng)度為600 V·cm-1、脈沖持續(xù)時(shí)間為10 ms，