均相電化學(xué)及熒光生物傳感新方法在癌癥標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、癌癥是威脅人類生命的主要疾病之一，在臨床醫(yī)學(xué)中大部分癌癥到晚期才能確診，如果能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷，可以有效控制病情，降低死亡率。近年來，癌癥標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)為癌癥的早期診斷提供了可能，針對癌癥標(biāo)志物的檢測已成為分析化學(xué)領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。均相DNA生物傳感器具有簡單快速、靈敏度高、穩(wěn)定性強、生物相容性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于基因分析、疾病診斷等領(lǐng)域。本論文利用核酸分子構(gòu)建了均相DNA生物傳感器，實現(xiàn)了癌癥標(biāo)志物的高靈敏檢測。
　　系統(tǒng)介紹了

2、 DNA生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)和檢測原理，并重點介紹了電化學(xué)和光學(xué)DNA生物傳感器。進(jìn)一步概述了核酸擴(kuò)增技術(shù)，并對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、端粒酶和microRNA進(jìn)行了介紹。
　　基于甲基化引發(fā)的核酸外切酶 III輔助等溫自發(fā)循環(huán)信號放大策略，構(gòu)建均相電化學(xué)生物傳感平臺，實現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的便捷、高靈敏檢測。在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，雙鏈DNA發(fā)生甲基化過程，被Dpn I識別并切割，釋放出單鏈DNA，在核酸外切酶III輔助下引發(fā)循環(huán)

3、切割過程，釋放出大量亞甲基藍(lán)（MB）標(biāo)記的短鏈DNA，擴(kuò)散到電極表面，實現(xiàn)電化學(xué)信號的放大。該策略實現(xiàn)了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的超靈敏檢測，檢測限可達(dá)0.004 U/mL，比文獻(xiàn)報道低1~2個數(shù)量級。
　　基于核酸外切酶T7輔助循環(huán)信號放大策略，首次建立了單細(xì)胞水平端粒酶活性均相電化學(xué)檢測新方法。當(dāng)端粒酶存在時，5′端標(biāo)記MB的發(fā)卡探針與延伸序列雜交，觸發(fā)核酸外切酶T7輔助的循環(huán)放大過程，釋放出大量亞甲基藍(lán)（MB）標(biāo)記的短鏈DNA，

4、擴(kuò)散到電極表面，實現(xiàn)電化學(xué)信號的放大。該項研究可檢測到單個HeLa細(xì)胞中的端粒酶活性，實現(xiàn)了單細(xì)胞水平端粒酶活性的均相電化學(xué)檢測。
　　基于目標(biāo)物觸發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR），首次構(gòu)建了免酶、免標(biāo)記均相電化學(xué)生物傳感平臺，實現(xiàn)了高靈敏miRNA電化學(xué)檢測。目標(biāo)miRNA可以觸發(fā)兩個亞穩(wěn)態(tài)發(fā)夾間的HCR，形成含有多個G四聯(lián)體的雙螺旋DNA長鏈，MB嵌插入G四聯(lián)體及DNA雙鏈后，其擴(kuò)散到電極表面的能力明顯減弱，導(dǎo)致電化學(xué)信號減小，從而實

5、現(xiàn)了“關(guān)信號”miRNA均相電化學(xué)檢測。該方法免酶、免標(biāo)記，具有靈敏度高、選擇性好、簡單、便捷、成本低等突出優(yōu)點。
　　基于等溫指數(shù)放大策略，利用氧化石墨烯吸附單鏈核酸并保護(hù)miRNA免受酶水解的性質(zhì)，建立了免標(biāo)記熒光檢測miRNA的新方法。發(fā)夾 DNA與目標(biāo)miRNA雜交，引發(fā)DNA聚合與鏈置換反應(yīng)，實現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)過程。形成的雙鏈DNA被內(nèi)切酶識別并切割，產(chǎn)生與目標(biāo) miRNA具有相同序列的觸發(fā) DNA，引發(fā)新的鏈增長過程，從而