對(duì)蝦中副溶血性弧菌產(chǎn)毒株的分離識(shí)別及抗菌肽的控制效應(yīng).pdf

1、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是典型的海洋性食物致病菌，是引起我國(guó)沿海地區(qū)細(xì)菌性食物中毒危害的首要致病菌，嚴(yán)重威脅人們的身體健康并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，解決卣VP引起的海產(chǎn)品的食源性安全問題是當(dāng)務(wù)之急。為解決這一問題，首先要建立靈敏、準(zhǔn)確的快速檢測(cè)技術(shù)，尤其是產(chǎn)毒菌株的識(shí)別與定量檢測(cè)，然后在此基礎(chǔ)上嘗試新的安全綠色的控制方法，以降低VP引發(fā)食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
　　免疫磁珠技術(shù)是一種靈敏快速檢測(cè)技

2、術(shù)，兼具免疫學(xué)的特異性和磁場(chǎng)分離的高效性。本論文利用標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒VP菌株的抗血清分別與S型和D型磁珠偶聯(lián)，選擇偶聯(lián)飽和吸附量大的磁珠，并以吸附量為指標(biāo)優(yōu)化活化劑選擇、偶聯(lián)時(shí)間、溫度等條件，初步建立了VP免疫磁珠的制備方法，即1mg S型磁珠，用0.1mL濃度為0.005g/L的活化劑活化磁珠，添加0.2mL的血清，在25℃下?lián)u床24h。通過靈敏度和特異性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)最佳偶聯(lián)條件下制備出的VP免疫磁珠具有較高的特異性和靈敏度，靈敏度達(dá)到5CFU/

3、mL。用免疫磁珠技術(shù)檢測(cè)VP，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間且操作更簡(jiǎn)單，成本較低，為以后的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　利用建立的免疫磁珠技術(shù)結(jié)合參照國(guó)標(biāo)法對(duì)本地夏秋季市售的鮮蝦、干蝦和冷凍蝦類產(chǎn)品中的VP進(jìn)行分離鑒定和產(chǎn)毒識(shí)別，同時(shí)采用最大可能數(shù)法評(píng)估市售對(duì)蝦中的VP污染水平，其中鮮蝦和干蝦的VP攜帶量超出了其中毒的感染劑量，必須采取有效的措施進(jìn)行控制。免疫磁珠檢測(cè)法與國(guó)標(biāo)法相比，可以縮短整體檢測(cè)時(shí)間，但在產(chǎn)業(yè)化綜合方面有待于進(jìn)一步研究完善。

4、　　由于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)VP溶血毒素標(biāo)準(zhǔn)品空缺，故本實(shí)驗(yàn)選用VP標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng)，結(jié)合超聲破碎、硫酸銨沉淀、DEAE纖維素柱層析等手段提取純化出溶血活度為24.81HU/mL溶血毒素，并在此基礎(chǔ)上建立其溶血毒素的相對(duì)溶血活度定量方法，得出在0.6-1.1 HU/mL個(gè)范圍內(nèi)，溶血活性與溶血毒素含量的線性關(guān)系為y=0.0141x+0.4921，1個(gè)相對(duì)HU相當(dāng)于36.02μg目標(biāo)物質(zhì)H2，用該方法可以對(duì)溶血毒素進(jìn)行快速宏觀定量評(píng)估。

5、r>　　芽孢桿菌抗菌肽抗菌譜較廣，對(duì)G+菌和G-菌均有較好的抑制作用，故本論文從納豆芽孢桿菌NT-6的培養(yǎng)物中提取抗菌肽類物質(zhì)，用牛津杯法驗(yàn)證其對(duì)VP的抑制作用，測(cè)定其最小抑菌濃度為1.25 mg/mL。并測(cè)定其對(duì)VP生長(zhǎng)曲線的影響、殺菌動(dòng)力學(xué)以及對(duì)蝦基質(zhì)對(duì)納豆菌抗菌肽殺滅VP效果的影響，結(jié)果顯示抗菌肽對(duì)VP有明顯的抑制作用，在VP生長(zhǎng)期任何時(shí)間加入一定濃度的抗菌肽均可抑制菌體繁殖，但芽孢桿菌抗菌肽NT-6對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VP較為敏感