海產(chǎn)品中副溶血性弧菌有機(jī)酸—溫度協(xié)同控制及其酸耐受調(diào)控因子的表達(dá)規(guī)律研究.pdf

1、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是海產(chǎn)品引發(fā)食源性胃腸疾病的主要病原菌。隨著水產(chǎn)品流通的加快，Vp引發(fā)中毒的食物不僅僅集中于海產(chǎn)品，由海產(chǎn)品加工不當(dāng)和交叉污染引起的Vp食源性疾病流行已呈上升趨勢(shì)，因此控制海產(chǎn)品中Vp的攜帶量顯得尤為重要。目前，海產(chǎn)品中Vp減除措施主要有暫養(yǎng)和凈化、溫度處理、高壓處理、輻射等，但是這些方法很難兼顧到除菌效果和海產(chǎn)品原有風(fēng)味的維持。近年來有許多學(xué)者提出有機(jī)酸可以用于食物保

2、鮮和儲(chǔ)藏，因此有機(jī)酸和其它減菌方法的聯(lián)合使用已成為控制食物中細(xì)菌載量的研究熱點(diǎn)。
　　細(xì)菌酸耐受細(xì)胞的形成是弱酸減菌化處理中的關(guān)鍵技術(shù)問題，但目前對(duì)Vp在弱酸性條件下的耐受機(jī)制尚不清楚。本文通過研究檸檬酸和溫度對(duì)海產(chǎn)品中Vp的協(xié)同抑制作用，建立了海產(chǎn)品中Vp減菌化處理方法。該方法不僅有效降低了Vp的攜帶量，還保持了海產(chǎn)品的鮮度。同時(shí)研究了Vp在弱酸性條件下產(chǎn)生的酸耐受誘導(dǎo)反應(yīng)，并探討了Vp的酸耐受調(diào)控因子表達(dá)規(guī)律，為建立海產(chǎn)品中V

3、p的高效減菌技術(shù)提供了理論依據(jù)。
　　1.有機(jī)酸和溫度對(duì)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的減菌效應(yīng)
　　采用響應(yīng)曲面分析法對(duì)Vp的減菌條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)Vp死亡率影響因素進(jìn)行單因素分析后，以Box-Benhnken設(shè)計(jì)(BBD)評(píng)價(jià)溫度、時(shí)間、pH三個(gè)因素顯著性和交互作用，得出Vp最佳減除條件為:溫度55.5℃、時(shí)間25s、pH4.96。在該條件下，Vp死亡率的預(yù)測(cè)值為97.36％，在三文魚模擬污染樣品中驗(yàn)證該值達(dá)97.07％，并且該條件

4、處理前后魚肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性沒有顯著差異。
　　2.副溶血性弧菌酸耐受誘導(dǎo)及其δ因子表達(dá)規(guī)律
　　本研究選取6株不同來源Vp，將其分別在pH5.5和pH7.5環(huán)境中適應(yīng)1h，再在pH4.0環(huán)境中脅迫1h，測(cè)定存活率。并在該條件下，采用相對(duì)定量法檢測(cè)cadA、toxR基因以及10種潛在的δ因子的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株RIMD2210663和VP098經(jīng)pH5.5環(huán)境適應(yīng)的存活率比經(jīng)pH7.5環(huán)境適應(yīng)的存活

5、率高，產(chǎn)生了酸耐受反應(yīng);菌株ATCC33847檢測(cè)不到存活細(xì)胞，其它菌株雖有存活，但經(jīng)pH5.5環(huán)境適應(yīng)的存活率比經(jīng)pH7.5環(huán)境適應(yīng)的存活率低，沒有產(chǎn)生酸耐受反應(yīng);cadA、VPA1690、VP2358基因在6種菌株中的表達(dá)均上調(diào)，VP2553、VPA1555、VP2210、VP2953基因表達(dá)上調(diào)的菌株能檢測(cè)到存活細(xì)菌，toxR基因表達(dá)上調(diào)的菌株產(chǎn)生了酸耐受反應(yīng)。
　　大流行株RIMD2210663在不同pH適應(yīng)處理1h后，再

6、在pH4.0環(huán)境中脅迫1h后，測(cè)定其存活率，并檢測(cè)cadA、toxR以及10種潛在的δ因子的表達(dá)水平，分析RIMD2210663在酸脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)與適應(yīng)pH和存活率的關(guān)系。結(jié)果表明所選目的基因都是低pH誘導(dǎo)表達(dá)的基因，其中cadA、VP2358、VP2578的表達(dá)受環(huán)境pH影響顯著高于其它基因;cadA、toxR、VP0055、VPA1555、VPA1690、VP2232、VP2578、VP2670、VP2953基因在存活率達(dá)到2

7、.91％時(shí)表達(dá)量最高;VP2358基因在存活率達(dá)到17.7％時(shí)表達(dá)量最高;VP2553的表達(dá)量隨存活率的增加緩慢上升。不同pH適應(yīng)條件對(duì)cadA、toxR以及δ因子誘導(dǎo)表達(dá)具有顯著影響。雖然pH4.5和pH6.0適應(yīng)條件都可以誘導(dǎo)酸耐受相關(guān)基因的表達(dá)，并且pH4.5誘導(dǎo)表達(dá)水平較高，但是它們都不能誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生酸耐受反應(yīng)。其主要原因是pH4.5適應(yīng)階段大部分Vp已經(jīng)死亡;Vp雖然能在pH6.0適應(yīng)階段存活，但是酸耐受相關(guān)基因未被有效誘導(dǎo)表

8、達(dá)，使細(xì)胞酸耐受能力不強(qiáng)，無法抵抗致死酸環(huán)境。
　　3.VP2358在副溶血性弧菌酸耐受中的作用
　　以RIMD2210663基因組為模板，PCR擴(kuò)增VP2358上下游DNA序列，并以其為模板，通過重疊PCR獲得VP2358上下游序列拼接片段。將拼接片段克隆入pMD20-T載體，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-⊿VP2358。通過PstI單酶切，回收pMD-⊿VP2358中的VP2358上下游拼接片段，并將其與自殺質(zhì)粒pDS132連

9、接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入s17感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pDS132-⊿VP2358。通過第一輪重組，篩選出含有pDS132-⊿VP2358質(zhì)粒的RIMD2210663。將其通過第二輪重組，用氯霉素抗性LC平板反向篩選，結(jié)合靶基因內(nèi)外引物PCR鑒定，成功構(gòu)建出缺失株RIMD2210663⊿VP2358。
　　將突變株RIMD2210663⊿VP2358及其野生株在pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH7.5，37℃環(huán)境中分別適

10、應(yīng)1h后，再在pH4.0，37℃環(huán)境中脅迫處理1h，測(cè)定存活率。結(jié)果表明，突變株經(jīng)不同pH環(huán)境適應(yīng)后，其對(duì)致死酸環(huán)境的抵抗力低于野生株。進(jìn)一步研究顯示，在酸適應(yīng)過程中VP2358的缺失對(duì)δ因子和酸耐受基因的表達(dá)水平也產(chǎn)生了影響。將突變株和野生株在pH5.5環(huán)境中適應(yīng)1h，再在pH4.0環(huán)境中脅迫1h后，以野生株為對(duì)照，檢測(cè)突變株cadA、rpoS、toxR基因的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明突變株cadA、rpoS、toxR基因的表達(dá)量分別是野