米曲霉FS-1脂肪酶發(fā)酵優(yōu)化、分離純化與酶學特性的研究.pdf

1、對米曲霉FS-1產脂肪酶進行發(fā)酵優(yōu)化。首先通過單因素實驗,確定發(fā)酵最適碳源為玉米粉,氮源為蛋白胨。然后通過Plackett-Burman試驗設計對培養(yǎng)基中的8個成分進行篩選,得到對影響產酶結果最顯著的3個培養(yǎng)基成分是蛋白胨、橄欖油和Na2HPO4。通過Box-Behnken中心組合設計對以上3個顯著成分進行優(yōu)化,獲得三成分的最佳組合。優(yōu)化后的最適培養(yǎng)基配方為(g/L):玉米粉0.5,蛋白胨50,橄欖油15,NaNO310,Na2HPO4

2、2.5,KCl0.5,MgSO40.5,FeSO40.01。發(fā)酵條件優(yōu)化獲得最適條件:接種量2％,裝液量20ml/250mL三角瓶,發(fā)酵溫度為28℃,發(fā)酵初始pH為8.0,發(fā)酵時間為48h。產酶水平從初始的3.25U/mL提高到18.75U/mL。
　　 FS-1脂肪酶的分離純化。收集發(fā)酵液上清,上清分別經過60％硫酸銨沉淀、透析除鹽、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析等純化步驟,純化后的酶的比活力為2

3、87.81U/mg、純化倍數(shù)為9.21、回收率為26.39％,SDS-PAGE電泳測定蛋白質純度,電泳圖譜為單一條帶,表明純化得到較純蛋白樣品。
　　 FS-1脂肪酶理化性質的測定。該酶分子量為40.64 kDa。最適酶促反應溫度為36℃,40℃以內酶的熱穩(wěn)定性好。最適酶促反應pH值為7.0,在pH值為3.0-9.0的范圍內相對穩(wěn)定。以橄欖油、三丁酸甘油酯為底物分別進行酶的動力學研究,結果表明,兩者的酶促反應都符合米氏方程,最大

4、反應初速度Vm分別為23.70μmol/mL/min,24.33μ mol/mL/min,米氏常數(shù)Km分別為48.44μ mol/mL、20.43μmol/mL,反應活化能(Ea)分別為41.78 kJ/mol、31.68 kJ/mol。
　　 不同效應物對FS-1脂肪酶活力的影響。(1)金屬離子對酶活力的影響:一價金屬離子Na+、K+、Li+以及二價金屬離子Ba2+對酶促反應無影響。Ca2+對酶活力有促進作用；二價金屬離子Mg

5、2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+以及三價金屬離子Fe3+、Al3+對酶活都有不同程度的抑制作用。(2)有機溶劑對酶活力的影響:甲醇、乙醇、甲醛、異丙醇對酶均有不同程度的抑制作用；甲醛對酶抑制作用最強烈；正戊烷對酶活力沒影響。(3)不同化學修飾劑對酶活力的影響:順丁烯二酸酐、溴乙酸、N-乙酰咪唑、β-巰基乙醇、乙酰丙酮、氯胺-T、N-溴代丁二酰亞胺、苯甲基磺酸鈉(PMSF)這8種修飾劑中,只有β-巰基乙醇和苯甲基磺酸鈉對酶產生影響,初步