水環(huán)境細(xì)胞Ⅰ型整合子整合酶基因與基因盒陣列調(diào)控的研究.pdf

1、抗生素的使用甚至是濫用導(dǎo)致了全球范圍內(nèi)多重耐藥菌的廣泛傳播。耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性頻發(fā)的主要原因之一，整合子作為細(xì)菌內(nèi)常見的移動遺傳元件，在耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著很大的作用。Ⅰ型整合子是最常見的整合子，具有捕獲、整合和切除耐藥基因的活性。它主要是有以下幾部分組成:編碼整合酶的intⅠ基因，attⅠ重組位點(diǎn)，負(fù)責(zé)耐藥基因盒轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動子Pc以及調(diào)控整合酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動子Pint。Pc啟動子有時會與另一個啟動子P2聯(lián)合

2、起作用，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種不同強(qiáng)度的Pc變體，但是在我國水環(huán)境中有關(guān)Pc變體的相對分布的研究還沒有太清楚。
　　Pc啟動子和整合子啟動子反向重疊，它的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄活性會影響著整合酶的表達(dá)，已經(jīng)有研究表明整合酶啟動子Pint有LexA盒(LexA box)，是細(xì)菌中的一個關(guān)鍵SOS反應(yīng)蛋白。因此，有關(guān)SOS反應(yīng)與細(xì)菌整合酶與耐藥基因盒表達(dá)調(diào)控的研究已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)。已有研究表明在霍亂弧菌中，整合酶與基因盒的表達(dá)是共調(diào)節(jié)的。某些抗生素

3、的加入會誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生SOS反應(yīng)，從而增強(qiáng)其整合酶的表達(dá)活性。在營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基、高溫、和高鹽濃度中，兩種啟動子活性均有增強(qiáng)，然而在大腸桿菌中，關(guān)于SOS反應(yīng)對整合酶與基因盒表達(dá)方面的研究卻鮮有報道。
　　本文首先對從濟(jì)南五個不同水環(huán)境取樣點(diǎn)采集水樣中分離的多重耐藥菌整合子的Pc啟動子進(jìn)行鑒定，通過PCR的方法，共發(fā)現(xiàn)4種Pc啟動子變體，分別為PcW、PcWTGN-10，PcH1和PcW-P2，其中PcWTGN-10和PcW-P2是其

4、他兩種啟動子的重組產(chǎn)物，在自然水環(huán)境中四種Pc所占比例分別為54.29％，34.26％，8.57％和2.88％，低強(qiáng)度Pc啟動子存在頻率較高。
　　在前面調(diào)查工作的基礎(chǔ)上，我們克隆了其中三種具有代表性的Pc變體(PcW、PcWTGN-10，PcH1)，和Pint一起以雙向啟動子方式連接入載體質(zhì)粒，通過不同條件對其進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察Pc與Pint的變化關(guān)系，分析其調(diào)控機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒有任何選擇壓力存在的條件下，三種Pc的強(qiáng)弱關(guān)系依次為

5、PcWTGN-10≈PcH1＞PcW;而與之對應(yīng)的Pint的強(qiáng)弱關(guān)系則是剛好相反，即為Pint(PcW)＜Pint(PcWTGN-10)≈Pint(PcH1);當(dāng)環(huán)境中存在低濃度抗生素時，Pint的活性會因此變強(qiáng)，與此同時Pc的強(qiáng)度會增強(qiáng)，而且該抗生素對Pint啟動子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)是屬于SOS調(diào)控;當(dāng)環(huán)境中存在低濃度化學(xué)物質(zhì)時，它會使整合子中的雙向啟動子Pc-Pint活性發(fā)生變化，PTA(精對苯二甲酸)和BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯

6、酚）可以上調(diào)整合酶的剪切和捕獲耐藥基因盒的活性，更有利于耐藥菌產(chǎn)生對環(huán)境的適應(yīng)性;當(dāng)水溫不同時，我們可以看出高溫可以促進(jìn)Pc和Pint的表達(dá)，而這種調(diào)控與我們所分析的SOS調(diào)控關(guān)系不大。
　　我們的研究結(jié)果表明水環(huán)境中殘留的抗生素和化學(xué)物質(zhì)，會通過細(xì)菌SOS反應(yīng)，調(diào)控耐藥基因的重組與表達(dá)，促進(jìn)耐藥基因在微生物中的產(chǎn)生和傳播。因此，環(huán)境殘留有害物質(zhì)不僅對耐藥微生物的富集起作用（耐藥基因盒表達(dá)），而且促進(jìn)了耐藥基因的進(jìn)化（耐藥基因盒表