穩(wěn)定表達牛胰蛋白酶的MDCK細胞的構建及對流感病毒增殖影響的研究.pdf

1、流感疫苗是目前預防流感發(fā)生和傳播最為有效的手段。傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)流感疫苗系統(tǒng)存在一些不足之處,比如培養(yǎng)的流感病毒易發(fā)生抗原變異,與人群流行株不能完全匹配;殘留卵清蛋白易引起過敏反應;尤其當出現(xiàn)大流行時健康雞胚供應受限不能滿足短時間內(nèi)對疫苗的大量需求。而哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠避免這些問題,成為未來疫苗生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。臨床試驗表明使用 MDCK等細胞生產(chǎn)的流感疫苗是安全的并有高免疫原性,然而較低的病毒滴度是其大規(guī)模生產(chǎn)的瓶頸之一。流感病毒血

2、凝素HA被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1和HA2,才能夠介導病毒囊膜與靶細胞膜融合,起始病毒生命周期,因此HA的裂解是病毒感染細胞的首要前提,而MDCK細胞本身并不具備裂解HA的蛋白酶類,成為產(chǎn)量提升的限制因素。研究證明外加胰蛋白酶能夠有效地提高病毒產(chǎn)量,本研究采取基因工程手段將胰蛋白酶基因導入 MDCK細胞,構建能夠自主表達裂解病毒的蛋白酶的細胞系,用于疫苗規(guī)模化生產(chǎn),簡化生產(chǎn)工藝或更加有效地使疫苗產(chǎn)量提升。
　　胰蛋白酶本身存在

3、酶原和酶兩種形式,而自然狀態(tài)人呼吸道上皮細胞中,蛋白酶裂解HA可能發(fā)生在胞外、胞內(nèi)或與胞膜相關,為此我們構建了酶原和酶兩種形式,分泌、胞內(nèi)、跨膜3種細胞分布的共6種真核表達載體?；蚝铣闪送暾呐Ｒ鹊鞍酌副磉_序列,設計引物去除 N端分泌信號肽或酶原激活肽的核苷酸序列, PCR擴增并克隆了分泌型酶原和酶、胞內(nèi)型酶原和酶的表達序列;借鑒跨膜絲氨酸蛋白酶HAT基因的跨膜區(qū)TM,設計引物使TM和胰酶基因各有部分序列重疊,采用重疊PCR擴增克隆出

4、跨膜型酶原和酶的目的基因。6條目的序列引入Kozak序列和NheI和EcoRI酶切位點,保持正確的開放閱讀框,雙酶切連接至pcDNA3.1真核表達載體,從而構建了3種細胞分布2種酶型的真核重組表達質粒。
　　大量提取無內(nèi)毒素高純度的表達質粒,經(jīng)脂質體轉染MDCK細胞,建立了目的基因的瞬時表達體系。免疫印跡實驗證明載體成功表達且表達蛋白大小符合預期,分別為分泌酶原24.3kD、分泌酶23.4kD、胞內(nèi)酶原24.3kD、胞內(nèi)酶23.4

5、kD、跨膜酶原30.2kD、跨膜酶29.2kD。間接免疫熒光實驗顯示表達亞細胞分布正確。以特異熒光底物法檢測各型表達蛋白酶活性發(fā)現(xiàn)分泌型酶原的活性最高,轉染該質粒的MDCK培養(yǎng)甲型流感疫苗株培養(yǎng)72h病毒的產(chǎn)量的增加有統(tǒng)計意義,從而篩選出分泌酶原為重組細胞活化病毒的最佳表達作用模式。
　　利用G418抗性篩選和有限稀釋法克隆,通過PCR、RT-PCR及間接免疫熒光鑒定,獲得了穩(wěn)定表達分泌型牛胰蛋白酶原的細胞株命名為 MT21。將該

6、單克隆細胞連續(xù)傳代15代次后仍可保持完整的外源基因,檢測連續(xù)傳代細胞表達上清胰酶活性沒有統(tǒng)計差異,目的蛋白表達穩(wěn)定。
　　將單克隆細胞 MT21與正常 MDCK細胞分別在有無外加低濃度(0.5μg/ml) TPCK-trypsin條件下,以0.001的感染復數(shù)接種野生H1N1、H3N2、B型流感病毒株及甲流疫苗株,收集無血清37℃培養(yǎng)24h、48h、72h的病毒測定NA活性、繪制病毒生長曲線,檢測72h各病毒CCID50滴度,結果