實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測食品中單核增生李斯特氏菌的研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogens，LM，簡稱為單增李斯特氏菌）是李斯特菌屬中主要致病菌，生命力頑強(qiáng)，生長溫度范圍較廣，可以廣泛存在于自然界，是最致命的食源性病原體之一。食用被該菌污染的食物可以導(dǎo)致人和動(dòng)物腦膜炎、流產(chǎn)、敗血癥等，病死率高達(dá)20％-30％。世界各地每年均有報(bào)道由該菌爆發(fā)引起的食品安全事件，我國進(jìn)出口每年也發(fā)生多起從國外引進(jìn)的食物被檢出該菌而將其退回的事例。因食品中存在大量微生物，該菌在食品

2、中的量也較小，故而檢出該菌存在一些困難，該菌的檢測、鑒定以及防控技術(shù)一直受到極大的關(guān)注。因此建立可靠的快速檢測方法，對食品中單增李斯特氏菌的主動(dòng)監(jiān)測和污染控制刻不容緩。目前我國檢測該菌的方法一直沿用傳統(tǒng)的分離鑒定方法，操作復(fù)雜，用時(shí)較長，已不能適應(yīng)現(xiàn)代快速檢測的要求，需要開發(fā)更好更快的檢測方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）是近年來發(fā)展出來的一種新穎的核酸體外等

3、溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有簡單、快速、特異性強(qiáng)、高度敏感的特點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于病原菌檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、醫(yī)學(xué)應(yīng)用等諸多領(lǐng)域。
　　本試驗(yàn)將熒光與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合到一起，利用新型儀器—實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測儀實(shí)時(shí)監(jiān)測產(chǎn)物擴(kuò)增情況，這臺(tái)儀器可以與電腦相連，將LAMP擴(kuò)增情況數(shù)據(jù)化，作出相應(yīng)的圖以供查看，該方法被稱為實(shí)時(shí)熒光環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Real-TimeFluorescence Loop Mediated Isothermal Amplific

4、ation，簡稱為RTF-LAMP)。
　　本研究采用單增李斯特氏菌的inlB基因?yàn)樵囼?yàn)靶基因設(shè)計(jì)并篩選出一對特異性引物，利用實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測儀62℃孵育反應(yīng)60min對單增李斯特氏菌進(jìn)行檢測。最終確定的RTF-LAMP的反應(yīng)體系為:反應(yīng)內(nèi)引物FIP和BIP各3.5μmol/L，反應(yīng)內(nèi)引物F3和B3各0.5μmol/L，其它反應(yīng)組分分別為:3mM dNTPs，1mM MgCl2,2.5μL10×Bst聚合酶酶緩沖液，1μL800U B

5、stDNA聚合酶，1μL模板DNA，甜菜堿0.5mmol/L，1∶400熒光染料0.5μL，純水補(bǔ)足體積到25μL。
　　本研究以3株單增李斯特氏菌和17株非單增李斯特氏菌作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行RTF-LAMP試驗(yàn)的引物特異性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果均為單增李斯特氏菌株，而其他的非單增李斯特氏菌株結(jié)果均顯示為陰性，由此證明試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物特異性良好，可用于該菌的檢測。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)將單增李斯特氏菌人工污染熏肉并測定其檢出限為35 CFU/g。本研