實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌的研究.pdf

1、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）為革蘭氏陰性菌，是一種普遍存在于大自然中的條件致病菌。阪崎腸桿菌不僅能夠存在于受污染的食品和食品廠中，而且在包括家居在內(nèi)的幾乎所有環(huán)境中都能分離到。阪崎腸桿菌感染可以引起嬰幼兒尤其是新生兒患病，產(chǎn)生比較嚴重的疾病如腦膜炎、菌血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎等，甚至會引起嚴重的后遺癥或者死亡。目前發(fā)現(xiàn)，只有嬰幼兒奶粉與疾病的暴發(fā)相關(guān)。因此，建立一種在嬰幼兒奶粉中高效靈敏的檢測阪崎腸桿菌的方法

2、是至關(guān)重要的。實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(RF-LAMP)是以環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)為理論依據(jù)，將熒光染料與LAMP技術(shù)相結(jié)合，利用恒溫擴增實時熒光檢測系統(tǒng)（DEAOU ARTⅡ）通過熒光信號的累積監(jiān)測RF-LAMP反應(yīng)的進程，對模板進行實時分析，直觀分析目的基因的擴增結(jié)果，自動顯示檢測結(jié)果的陰陽性。
　　根據(jù)阪崎腸桿菌在GenBank中16SrRNA基因(HQ880288.1)，利用在線軟件（http://www.pri

3、merexplorer.jp/e/）進行引物設(shè)計，對Mg2+濃度、dNTPs濃度、反應(yīng)溫度等擴增條件進行優(yōu)化，確定25μL的RF-LAMP反應(yīng)體系:10μM FIP和BIP各3.5μL,10μMF3和B3各0.5μL,50mMMgSO41μL,2.5mmol/LdNTPs2μL,10×BstDNA聚合酶緩沖液，8000U/ml的BstDNA聚合酶0.8μL，2μLDNA模板，0.5μLSYBRGreenI(1∶100)，其余用滅菌雙蒸水

4、補足。
　　實時熒光LAMP反應(yīng)程序:掃描頻率為30s或60s一次，反應(yīng)溫度為63℃，反應(yīng)時間90min（通過觀察反應(yīng)情況隨時停止）。通過限制性內(nèi)切酶ACCⅢ酶切擴增產(chǎn)物，測得酶切片段與理論預(yù)期值相符，驗證了方法的正確性。
　　本研究對3株阪崎腸桿菌菌株和20株其他食源性致病菌菌株進行特異性試驗，試驗結(jié)果表明只有3株阪崎腸桿菌菌株檢測結(jié)果為陽性，其他20株食源性致病菌菌株均為陰性結(jié)果，表明本研究具有較高的特異性。
　　

5、比較實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)與PCR技術(shù)檢測阪崎腸桿菌的靈敏度和人工污染檢出限，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度和人工污染的嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌的檢出限都達到47CFU/mL，而PCR檢測方法僅為4.7×103CFU/mL。RF-LAMP技術(shù)是常規(guī)PCR技術(shù)的100倍，并且大大縮短了檢測時間。
　　研究表明，本研究所建立的實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌的方法具有特異性強