冰城鏈霉菌C5-酮基屬間接合轉(zhuǎn)移中斷菌株的構(gòu)建.pdf

1、米爾貝霉素具有廣譜、高效的抗寄生蟲活性，對(duì)宿主不良反應(yīng)極低，是目前理想的驅(qū)蟲、殺蟲藥物。其C5-肟米爾貝霉素的活性更高，并且殺蟲譜更廣，效果更好。而5-酮基米爾貝霉素由于其C5位酮基的化學(xué)性質(zhì)比較活潑，很容易合成5-肟米爾貝素衍生物，是化學(xué)合成5-肟米爾貝霉素衍生物的最佳前體，因此研究從米爾貝霉素A3、A4到5-酮基米爾貝霉素A3、A4的生物合成途徑具有重要的意義。冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是

2、本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的一株新的吸水鏈霉菌菌株，是米爾貝霉素(milbemycin)和冰城霉素(bingchengmycin)的重要產(chǎn)生菌。冰城鏈霉菌的代謝產(chǎn)物具有較好的殺蟲活性和高效防治能力。接合轉(zhuǎn)移作為基因轉(zhuǎn)移工具已在多種鏈霉菌中成功應(yīng)用，此方法既可以避開胞外核酸酶使DNA免遭降解，在一定程度上還可以克服宿主對(duì)外源DNA的限制性修飾提高轉(zhuǎn)化效率。binF基因(C5-酮基還原酶基因)是在冰城鏈霉菌中負(fù)責(zé)編碼催化大環(huán)內(nèi)酯類抗生素C5位的酮基轉(zhuǎn)化為

3、羥基的還原酶基因，序列較保守。
　　 本研究通過(guò)分子生物學(xué)的方法對(duì)binF基因進(jìn)行失活，從而獲得產(chǎn)生C5-酮基米爾貝霉素的生產(chǎn)菌株。以冰城鏈霉菌226541為研究材料，進(jìn)行了大腸桿菌-冰城鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)，嘗試了冰城鏈霉菌中binF基因的中斷工作。為了進(jìn)一步研究binF基因在冰城鏈霉菌226541中的功能，本研究利用生物信息學(xué)分析冰城鏈霉菌的基因組信息，確定binF基因位置及相鄰序列，設(shè)計(jì)引物binF-L1、binF

4、-L2和binF-R1、binF-R2，在冰城鏈霉菌226541總DNA中擴(kuò)增binF基因的兩翼序列，與pMD19-TVector連接構(gòu)建出質(zhì)粒 pBC1130，在兩翼中間插入硫鏈絲菌素抗性基因(tsr)構(gòu)建出質(zhì)粒pBC810。然后利用HindⅢ和BamHⅠ酶切兩翼，與pKC1139連接構(gòu)建中斷質(zhì)粒pBC3129，并用 PCR和測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證了中斷質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。將binF中斷質(zhì)粒pBC3129轉(zhuǎn)入ET12567(PUZ8002)獲得接

5、合轉(zhuǎn)移供體菌ET12567(pUZ8002/pBC3129)，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入冰城鏈霉菌226541中，得到陽(yáng)性接合子。對(duì)接合子進(jìn)行抗生素穩(wěn)定性和分子生物學(xué)篩選，最終得到binF基因中斷菌株。冰城鏈霉菌226541與大腸桿菌ET12567(pUZ8002/pBC3129)的接合轉(zhuǎn)移體系為：冰城鏈霉菌226541孢子28℃孵育30 min，大腸桿菌OD600值為0.2，混合涂布于含有30 mM MgCl2的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)16h覆蓋抗生