胰島素及其類似物對甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響及與其相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的研究.pdf

1、前言：
　　 近年來,胰島素類似物逐漸成為糖尿病治療的首選[1]。雖然通過DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的胰島素類似物在分子結(jié)構(gòu)上有別于人類胰腺產(chǎn)生的胰島素,但其作用與人類胰島素相同。胰島素與類胰島素生長因子(IGF)分別與其特定的受體胰島素受體(IR)和類胰島素生長因子受體(IGF-IR)相結(jié)合并在細(xì)胞增殖方面發(fā)揮一定的作用[2-3]。通過刺激受體促進(jìn)生長增殖作用常常通過MAPK與PI3K-AKT信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)來完成,該通路通過基因表達(dá)

2、調(diào)節(jié)來影響細(xì)胞的生長及分化。胰島素類似物的結(jié)構(gòu)修飾可改變其與胰島素受體或類胰島素生長因子受體的親和力,因此胰島素類似物可能增強細(xì)胞的促有絲分裂能力。目前有文獻(xiàn)報道大鼠乳腺細(xì)胞株B10Asp通過胰島素類似物的刺激后具有很強促有絲分裂能力,因此對糖尿病病人使用胰島素類似物治療的安全性引起了越來越多學(xué)者的重視[4-6]。很多學(xué)者對胰島素類似物刺激非致瘤性或癌癥細(xì)胞株[正常人乳腺上皮細(xì)胞株(MCF10與HMEC)[9],人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-

3、7)[10],骨肉瘤細(xì)胞株(Saos/B10)。[11],肝細(xì)胞瘤細(xì)胞(HepG2)][12]后產(chǎn)生的促有絲分裂能力進(jìn)行了研究,然而卻得出了不同的結(jié)果。但這些結(jié)果卻是通過不同的實驗方法,不同的實驗條件以及不同的統(tǒng)計方法獲得。比如,有學(xué)者觀察到胰島素類似物可引起各種腫瘤細(xì)胞及人正常乳腺上皮細(xì)胞具有更強的增殖能力,但也有學(xué)者通過對各種細(xì)胞系進(jìn)行了相似的研究,并未發(fā)現(xiàn)明確不同。甲狀腺癌細(xì)胞對于胰島素以及類胰島素樣生長因了的反應(yīng)非常靈敏,同時常

4、常過度表達(dá)胰島素受體以及類胰島素生長因了受體。因此,胰島素類似物可能刺激甲狀腺癌細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞的加速增殖。另外,Shukla[8]報道對于高類胰島素生長因子受體/胰島素受體比率的細(xì)胞株來說,甘精胰島素對其具有強烈的促細(xì)胞分裂能力。通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí),目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于胰島素類似物對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株(IHH4)作用的影響相關(guān)文獻(xiàn)報道。
　　 本篇文章的目的：
　　 1.檢測IHH4細(xì)胞株是否存在胰島素受體以及類胰島素生長因子受

5、體以及其相關(guān)比值。2.研究目前應(yīng)用于臨床的胰島素以及其類似物對IHH4細(xì)胞株的增殖影響.3研究在MAPK與PI3K-AKT通路中,胰島素及其類似物作用IHH4細(xì)胞株后對ERK1/2蛋白與AKT蛋白的影響。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1.細(xì)胞株
　　 甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株IHH4有內(nèi)分泌研究所關(guān)海霞教授惠贈。
　　 2.常規(guī)胰島素及胰島素類似物
　　 門冬胰島素insul

6、inaspart(B28Asphumaninsulin),
　　 賴脯胰島素insulinlispro(B28Lys,B29Pmhumaninsulin),
　　 甘精胰島素insulinglargine(A21Gly,B31Arg,B32Arghumaninsulin),
　　 地特胰島素insulindetemir(NN304)[B29Lys(-tetradecanoyl),desB30humaninsuli

7、n]
　　 優(yōu)泌樂Rhumaninsulinregular
　　 諾和靈Rhumaninsulinregular
　　 二、主要研究方法
　　 1、IHH4細(xì)胞株的培養(yǎng)。
　　 2、MTT法測定藥物對細(xì)胞是否存在促增殖作用。
　　 噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT](5mg/mL)染色法檢

8、測不同濃度的普通胰島素及胰島素類似物作用IHH4細(xì)胞株產(chǎn)牛的增殖作用。
　　 3、Westernblot檢測IR、IGF-IR、ERK1\2、pERK1\2、AKT、pAKT
　　 收集細(xì)胞提取總蛋白,BCA法檢測蛋白質(zhì)含量。進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)印至PVDF膜。封閉,IR、IGF-1R、ERK1\2、pERK1\2、AKT、pAKT一抗孵育過夜,相應(yīng)的二抗孵育,增強型化學(xué)發(fā)光(enhancechemilumine

9、scence,ECL),拍照,以總ERK1\2及總AKT為內(nèi)參照,進(jìn)行條帶灰度值分析。
　　 4、計學(xué)分析
　　 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示,以P＜0.05為判斷差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、IHH4細(xì)胞株類胰島素樣生長因子受體與胰島素受體的表達(dá)
　　 通過Westernblotting法對IHH4細(xì)胞株的類胰島素樣生長因子受體與胰島素受體進(jìn)行

10、蛋白水平的檢測,實驗結(jié)果表明IHH4同時表達(dá)類胰島素樣生長因子受體與胰島素受體,類胰島素樣生長因子受體與胰島素受體相比較后,前者含量輕度高于后者,該實驗中測得的兩者的比值為1.36/1。
　　 2、胰島素與胰島素類似物對IHH4細(xì)胞株的增殖影響
　　 通過不同的濃度的普通胰島素及胰島素類似物(1.5nM,15nM和150nM)對IHH4細(xì)胞株進(jìn)行增殖測定實驗發(fā)現(xiàn):普通胰島素與胰島素類似物作用該細(xì)胞株48小時后,普通胰島素

11、、賴脯胰島素、地特胰島素、門冬胰島素與未處理組相比,對IHH4細(xì)胞株并無明顯增殖活性作用,而甘精胰島素對IHH4增殖活性作用略有增強。但經(jīng)過對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,并未發(fā)現(xiàn)藥物之間的統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3、胰島素與胰島素類似物對IHH4細(xì)胞株ERK1/2蛋白及AKT蛋白活化影響
　　 通過Westernblotting法對樣品中的ERK1/2蛋白與AKT蛋白以及其磷酸化形式pERK1/2蛋白與pAKT蛋白含量進(jìn)行檢測,并以

12、樣品中的ERK1/2蛋白及PAKT蛋白作為內(nèi)參照,比較不同樣品通過不同刺激因素刺激后pERK1/2蛋白與pAKT蛋白含量的變化。本實驗數(shù)據(jù)表明在不同的濃度刺激下未處理組,胰島素類似物組及普通胰島素組中的磷酸化蛋白pERK1/2蛋白與pAKT蛋白含量并未發(fā)牛明顯的改變,統(tǒng)計學(xué)無明顯差異。推斷胰島素類似物并不能激活MAPK與PI3K-AKT信號傳導(dǎo)通路。
　　 結(jié)論：
　　 1、IHH4細(xì)胞株表達(dá)胰島素受體及類胰島素生長因子