雜合肽PM23的分子設(shè)計(jì)與表達(dá)和從豬血中提取血紅素技術(shù)的研究.pdf

1、抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMP)是生物界中廣泛存在的一類具有抗菌活性的短肽，是天然免疫系統(tǒng)中的重要免疫分子，具有抗菌譜廣、活性穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在食品、飼料、醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 Pleurocidin是從冬季比目魚的粘膜中發(fā)現(xiàn)的，對革蘭氏陰性和陽性菌具有廣譜抗性作用的小肽。Misgurin是從泥鰍中分離出來的、具有抗細(xì)菌和真菌活性而無溶血活性的抗菌肽。本實(shí)驗(yàn)以Pleurocid

2、in和Misgurin為基礎(chǔ)，依據(jù)抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，利用生物信息學(xué)工具計(jì)算了雜合肽的物化參數(shù)并預(yù)測了其二級結(jié)構(gòu)；其中雜合肽Pleurocidin(1-8)-Misgurin(7-21)，簡稱PM23，為α-螺旋抗菌肽，具有較強(qiáng)的正離子性和兩親性，是晟具潛力的雜合肽。根據(jù)所設(shè)計(jì)的PM23分子序列，并參考大腸桿菌偏愛密碼子，用化學(xué)合成法合成了PM23基因，同時(shí)在序列的兩端引入雙酶切位點(diǎn)，將該基因定向插入帶有相同酶切位點(diǎn)的融合表達(dá)載體p

3、GEX-4T-2中，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-PM23；將pGEX-4T-2-PM23轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，菌落PCR篩選陽性克隆，DNA測序驗(yàn)證插入序列；使用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，SDS-PAGE電泳和蛋白免疫印跡檢測表達(dá)產(chǎn)物；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化后，進(jìn)行腸激酶切割和抗菌活性檢測。菌落PCR和DNA測序證實(shí)了PM23基因已被正確地插入pGEX-4T-2載體中；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h后，受體菌中融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到峰值，此

4、時(shí)約占總蛋白量的20％；所表達(dá)的融合蛋白的分子量約為29KD，具有抑制大腸桿菌的活性；酶切結(jié)果表明，融合蛋白中含有分子量約為3KD的雜合肽PM23。 本研究為抗菌肽的生產(chǎn)提供了一條重要的途徑，并為進(jìn)一步研究抗菌肽的生產(chǎn)表達(dá)、結(jié)構(gòu)與功能和設(shè)計(jì)新型的抗菌肽藥物奠定了基礎(chǔ)。 血紅素是細(xì)胞蛋白的組成部分，具有多種生物學(xué)功能和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。利用豬血制備氯化血紅素能夠變廢為寶，同時(shí)防止廢棄血液直接排放可能帶來的環(huán)境危害，因此具有重

5、大的環(huán)保意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文選用超聲波破碎法和丙酮蒸餾法相結(jié)合的方式從豬血中制備氯化血紅素。 為研究超聲波破碎紅細(xì)胞的最佳條件，采用正交試驗(yàn)法，以血紅蛋白含量為指標(biāo)，研究了去離子水添加量、超聲波功率和超聲破碎時(shí)間對血紅蛋白濃度的影響。血紅蛋白含量的測定采用堿羚高鐵血紅素(AHD-575)法進(jìn)行。結(jié)果表明，去離子水加入量為紅細(xì)胞體積的1/5、超聲波功率250W和破碎時(shí)間10min是超聲波破碎紅細(xì)胞的最佳條件。 為了提高丙酮