抑制宋內志賀菌益生菌株的篩選及作用機制研究.pdf

1、應用益生菌制劑防治致病菌感染，具有安全和減少耐藥性等優(yōu)點，為控制致病菌感染性疾病提供了新的途徑。中國是一個乳酸菌資源十分豐富的國家，為乳酸菌的研究和開發(fā)利用提供了很好的平臺。本論文采用了有效的篩選路線，篩選出對腸道致病（S.sonnei）有特異性抑制作用的益生菌菌株，并對其抑制S.sonnei的機制進行了探討。
　　以傳統(tǒng)食品和糞便中分離的197株目標菌株為資源，以LGG為參考菌株，采用瓊脂擴散法初步篩選出了53株對致病菌S.so

2、nnei、E.coli和S.Typhimurium有不同的抑制作用的菌株，結果發(fā)現(xiàn)不同來源的菌株對致病菌的抑制性不同，其中23株乳酸菌對S.sonnei具有較強的抑制性。同時以HT-29細胞為模型，評價了53株初篩菌株的粘附特性，篩選出了具有粘附性的25株乳酸菌，即黏附指數(shù)大于50個細菌/100cells。結合這兩個指標，共篩選出13株乳酸桿菌（M5-L、J10-L、J21-L、Q8-L、X12-L、Q6-L、G15-L、F0421、I

3、N3432、IN3821、IN4025、IN4024、IN3623）作為初篩菌株，并研究了它們對模擬胃腸道環(huán)境的耐受性，結果發(fā)現(xiàn)不同來源的菌株對胃液的耐受性不同，采用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對初篩菌株進行了鑒定。
　　通過對13株乳酸桿菌和LGG發(fā)酵18h產生的抑菌化合物分析，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌的發(fā)酵上清液（CFCS）經過蛋白酶K處理、熱處理后并不影響其抑菌活性，而將CFCS的pH調整為6.5后，其抑菌活性消失。初步判斷乳酸桿菌產生的

4、主要抑菌物質是有機酸類物質，而不是抗菌肽類物質。通過進一步研究乳酸桿菌的CFCS和CFCS-pH6.5對S.sonnei的生長影響時發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌產生的有機酸對S.sonnei具有殺傷作用，2h后S.sonnei的活菌數(shù)下降了2.7-3.9個log值，而3h后，大多數(shù)乳酸桿菌的CFCS中檢測不到S.sonnei的活菌數(shù)。而在CFCS-pH6.5培養(yǎng)過程中，S.sonnei的生長沒有受到影響，與對照組的生長趨勢接近一致，說明其它的抑菌物質

5、沒有發(fā)揮作用，進一步證明了乳酸桿菌產生的抑菌化合物主要是有機酸。通過HPLC分析有機酸發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌產生的乳酸含量在183-293mmol/L之間。
　　以HT-29細胞為模型，研究了13株乳酸桿菌對S.sonnei排除、競爭和取代黏附作用。從中有效篩選出4株具有顯著抑制S.sonnei黏附作用的菌株M5-L、J10-L、Q8-L和F0421。其中的M5-L和F0421在三種作用方式中具有顯著抑制S.sonnei的黏附作用。對M5

6、-L、J10-L、Q8-L和F0421進行氯化鋰、高碘酸鈉和熱處理后，進行抑制S.sonnei的黏附作用，發(fā)現(xiàn)經過氯化鋰處理后，抑制黏附能力顯著下降，確定乳酸桿菌中S-層蛋白與S.sonnei競爭黏附位點是其抑制S.sonnei黏附的主要作用機制。SDS-PAGE分析M5-L、J10-L、Q8-L和F0421中提取的S-層蛋白，證明了S-層蛋白的存在，其中M5-L、J10-L和Q8-L中的主要S-層蛋白分子量為45kDa左右，而F042

7、1的主要S-層蛋白分子量為40kDa左右。通過對S-層蛋白中的氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，其中含有大量的疏水性氨基酸，其含量分別為40.52％、43.80%、41.45%和35.40%。考慮到M5-L和F0421在排除、競爭和取代S.sonnei黏附作用的效果都比較顯著，所以選擇M5-L和F0421這2株菌做進一步實驗。
　　最后研究了F0421和M5-L對S.sonnei引起上皮細胞屏障功能破壞的防護作用。免疫組化結果顯示，F(xiàn)0421能

8、夠阻止S.sonnei引起的ZO-1和occludin蛋白表達量的減少，而M5-L能夠阻止S.sonnei引起的occludin蛋白表達量的減少，表明其對S.sonnei引起的上皮細胞屏障功能損傷具有防護作用。通過ELISA測定各個處理組細胞上清液中IL-8和IL-10的含量變化，表明乳酸桿菌F0421和M5-L主要是通過抑制S.sonnei刺激HT-29細胞產生IL-8來保護上皮細胞免于損傷的，而對于IL-10產生的影響不顯著。經過1