抑制宋內(nèi)志賀菌益生菌株的篩選及作用機(jī)制研究.pdf

1、應(yīng)用益生菌制劑防治致病菌感染，具有安全和減少耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，為控制致病菌感染性疾病提供了新的途徑。中國(guó)是一個(gè)乳酸菌資源十分豐富的國(guó)家，為乳酸菌的研究和開發(fā)利用提供了很好的平臺(tái)。本論文采用了有效的篩選路線，篩選出對(duì)腸道致?。⊿.sonnei）有特異性抑制作用的益生菌菌株，并對(duì)其抑制S.sonnei的機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　以傳統(tǒng)食品和糞便中分離的197株目標(biāo)菌株為資源，以LGG為參考菌株，采用瓊脂擴(kuò)散法初步篩選出了53株對(duì)致病菌S.so

2、nnei、E.coli和S.Typhimurium有不同的抑制作用的菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的菌株對(duì)致病菌的抑制性不同，其中23株乳酸菌對(duì)S.sonnei具有較強(qiáng)的抑制性。同時(shí)以HT-29細(xì)胞為模型，評(píng)價(jià)了53株初篩菌株的粘附特性，篩選出了具有粘附性的25株乳酸菌，即黏附指數(shù)大于50個(gè)細(xì)菌/100cells。結(jié)合這兩個(gè)指標(biāo)，共篩選出13株乳酸桿菌（M5-L、J10-L、J21-L、Q8-L、X12-L、Q6-L、G15-L、F0421、I

3、N3432、IN3821、IN4025、IN4024、IN3623）作為初篩菌株，并研究了它們對(duì)模擬胃腸道環(huán)境的耐受性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的菌株對(duì)胃液的耐受性不同，采用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)初篩菌株進(jìn)行了鑒定。
　　通過(guò)對(duì)13株乳酸桿菌和LGG發(fā)酵18h產(chǎn)生的抑菌化合物分析，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌的發(fā)酵上清液（CFCS）經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理、熱處理后并不影響其抑菌活性，而將CFCS的pH調(diào)整為6.5后，其抑菌活性消失。初步判斷乳酸桿菌產(chǎn)生的

4、主要抑菌物質(zhì)是有機(jī)酸類物質(zhì)，而不是抗菌肽類物質(zhì)。通過(guò)進(jìn)一步研究乳酸桿菌的CFCS和CFCS-pH6.5對(duì)S.sonnei的生長(zhǎng)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)S.sonnei具有殺傷作用，2h后S.sonnei的活菌數(shù)下降了2.7-3.9個(gè)log值，而3h后，大多數(shù)乳酸桿菌的CFCS中檢測(cè)不到S.sonnei的活菌數(shù)。而在CFCS-pH6.5培養(yǎng)過(guò)程中，S.sonnei的生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，與對(duì)照組的生長(zhǎng)趨勢(shì)接近一致，說(shuō)明其它的抑菌物質(zhì)

5、沒(méi)有發(fā)揮作用，進(jìn)一步證明了乳酸桿菌產(chǎn)生的抑菌化合物主要是有機(jī)酸。通過(guò)HPLC分析有機(jī)酸發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌產(chǎn)生的乳酸含量在183-293mmol/L之間。
　　以HT-29細(xì)胞為模型，研究了13株乳酸桿菌對(duì)S.sonnei排除、競(jìng)爭(zhēng)和取代黏附作用。從中有效篩選出4株具有顯著抑制S.sonnei黏附作用的菌株M5-L、J10-L、Q8-L和F0421。其中的M5-L和F0421在三種作用方式中具有顯著抑制S.sonnei的黏附作用。對(duì)M5

6、-L、J10-L、Q8-L和F0421進(jìn)行氯化鋰、高碘酸鈉和熱處理后，進(jìn)行抑制S.sonnei的黏附作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)氯化鋰處理后，抑制黏附能力顯著下降，確定乳酸桿菌中S-層蛋白與S.sonnei競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)是其抑制S.sonnei黏附的主要作用機(jī)制。SDS-PAGE分析M5-L、J10-L、Q8-L和F0421中提取的S-層蛋白，證明了S-層蛋白的存在，其中M5-L、J10-L和Q8-L中的主要S-層蛋白分子量為45kDa左右，而F042

7、1的主要S-層蛋白分子量為40kDa左右。通過(guò)對(duì)S-層蛋白中的氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，其中含有大量的疏水性氨基酸，其含量分別為40.52％、43.80%、41.45%和35.40%?？紤]到M5-L和F0421在排除、競(jìng)爭(zhēng)和取代S.sonnei黏附作用的效果都比較顯著，所以選擇M5-L和F0421這2株菌做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　最后研究了F0421和M5-L對(duì)S.sonnei引起上皮細(xì)胞屏障功能破壞的防護(hù)作用。免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)0421能

8、夠阻止S.sonnei引起的ZO-1和occludin蛋白表達(dá)量的減少，而M5-L能夠阻止S.sonnei引起的occludin蛋白表達(dá)量的減少，表明其對(duì)S.sonnei引起的上皮細(xì)胞屏障功能損傷具有防護(hù)作用。通過(guò)ELISA測(cè)定各個(gè)處理組細(xì)胞上清液中IL-8和IL-10的含量變化，表明乳酸桿菌F0421和M5-L主要是通過(guò)抑制S.sonnei刺激HT-29細(xì)胞產(chǎn)生IL-8來(lái)保護(hù)上皮細(xì)胞免于損傷的，而對(duì)于IL-10產(chǎn)生的影響不顯著。經(jīng)過(guò)1