AcrAB-TolC主動外排泵與宋內志賀菌多重耐藥關系的研究.pdf

1、目的：
　　研究宋內志賀菌臨床分離株的耐藥表型，探索宋內志賀菌AcrAB-TolC主動外排泵基因及其調控基因與多重耐藥的關系，闡明細菌多重耐藥的分子機制，為指導臨床合理使用抗菌藥物，遏制多重耐藥菌株的產生以及新藥研發(fā)提供理論依據。
　　方法：
　　1、宋內志賀菌的收集、鑒定和藥物敏感性分析:收集濟南市疾病預防控制中心和濟南市第四人民醫(yī)院保存的宋內志賀菌共41株，通過生化反應和血清學方法對菌株進行鑒定。采用瓊脂紙片擴散法

2、和E-test法測定所有菌株對7種抗菌藥物（氨芐西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素、復方新諾明）的耐藥性。
　　2、宋內志賀菌主動外排模型的構建以及泵抑制劑的干預:選取兩株宋內志賀菌野生株，以環(huán)丙沙星為誘導劑，通過不斷誘導培養(yǎng)使其轉變?yōu)槟退幹辏珽-test法測定誘導后菌株對7種抗菌藥物（氨芐西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素、復方新諾明）的MIC值，比較誘導前后MIC值的變化。采用常量肉湯稀釋法比較

3、加入主動外排泵抑制劑PAβN前后誘導耐藥株對環(huán)丙沙星的MIC值變化，分析外排泵抑制劑對耐藥表型的影響。
　　3、AcrAB-TolC主動外排泵基因(acrA、acrB和tolC)及泵阻遏基因(acrR、marR)的檢測以及mRNA的表達:用聚合酶鏈反應擴增全部試驗菌株的acrA、acrB、tolC、acrR和marR基因。采用實時熒光定量PCR進行熒光定量分析，以16sRNA為參照，分析誘導前后泵基因和調節(jié)基因的基因表達水平的變化

4、。
　　結果：
　　1、藥敏結果:41株宋內志賀菌對抗菌藥物的耐藥率分別為:氨芐西林(41.5％)，頭孢噻肟(12.2％)，環(huán)丙沙星(0)，慶大霉素(46.3％)，氯霉素(0)，四環(huán)素(85.4％)，復方新諾明(85.4％)。41株宋內志賀菌中有36株耐藥，耐藥率為87.8％(36/41)，其中16株對超過4種抗菌藥物耐藥，即有39％的宋內志賀菌表現為多重耐藥。耐藥模式有6種，以TS最多，占41.5％。5株菌株對所有抗菌藥物

5、敏感。
　　2、宋內志賀菌誘導結果和加入外排泵抑制劑后耐藥表型的變化:通過69代誘導傳代，誘導菌株對環(huán)丙沙星的MIC達64μg/mL，對其他幾種結構不同的抗菌藥物也產生了不同程度的耐藥，經過環(huán)丙沙星的誘導，原來的敏感菌株均逐步轉變?yōu)槎嘀啬退幹?。加入主動外排泵抑制劑PAβN后，誘導后的多重耐藥菌株對環(huán)丙沙星的MIC值出現明顯下降，但未達到誘導前的敏感水平。
　　3、AcrAB-TolC主動外排泵基因、泵調節(jié)基因檢測及mRNA的

6、表達情況:所有菌株均擴增出大小分別為1194bp，3150bp，1582bp，512bp和426bp的片段，分別為acrA,acrB，tolC，acrR和marR基因擴增產物，未發(fā)現基因缺失株。誘導耐藥株的acrR和marR基因表達水平明顯低于敏感株，acrA、acrB和tolC基因表達水平明顯高于敏感株。
　　結論：
　　1、41株宋內志賀菌對氨芐西林、慶大霉素、四環(huán)素、復方新諾明的耐藥率均超過了40％，但對頭孢菌素類和磺

7、胺類敏感性較高，臨床在治療宋內志賀菌感染引起的痢疾可選用敏感性較高的藥物。
　　2、AcrAB-tolC主動外排模型建立后，經過誘導的敏感菌株除了對誘導劑環(huán)丙沙星產生耐藥外，還對其他幾種抗菌藥物也產生了耐藥，這幾種藥物與環(huán)丙沙星在結構和作用機制上均不相同，且經證實均為主動外排泵AcrAB的作用底物。另外，在加入主動外排泵能量抑制劑PAβN后，誘導耐藥后的菌株的MIC均有不同程度的降低，這說明主動外排系統(tǒng)的激活可能是誘導株多重耐藥性