過敏原TBb抗原表位區(qū)及其關(guān)鍵氨基酸的鑒定.pdf

1、蕎麥?zhǔn)且环N藥食同源的作物，具有較高的營養(yǎng)、藥用及保健價值。蕎麥中富含礦物質(zhì)、膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素和多酚類化合物等生物活性物質(zhì)，能防治糖尿病、高血壓和冠心病等多種疾病。但是，越來越多的研究表明，蕎麥中具有的一些成分可使人們在接觸或食用它后產(chǎn)生多種過敏癥狀，如哮喘、皮炎等，嚴(yán)重的還可以引起休克甚至死亡。而引起這些過敏反應(yīng)的只是養(yǎng)麥蛋白質(zhì)中的部分抗原決定簇，也就是指蛋白質(zhì)中能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的數(shù)個至數(shù)十個氨基酸，其又被稱作“表位”(epi

2、tope)。蕎麥過敏原蛋白分子和其過敏機(jī)制的研究對于蕎麥過敏癥的精確診斷和安全治療至關(guān)重要且刻不容緩。
　　本課題組先前的研究已經(jīng)獲得一種編碼苦蕎全長過敏原的cDNA序列，并且命名為TBt，于2006年在GenBank上登錄(登錄號為DQ849083)。根據(jù)生物信息學(xué)的分析結(jié)果，苦蕎全長過敏原TBt包含兩個結(jié)構(gòu)域，即C端結(jié)構(gòu)域(TBa)和N端結(jié)構(gòu)域(TBb)。進(jìn)一步分析表明，分子量約35 kD的TBb是苦蕎麥中引起過敏的主要過敏原

3、之一，然而，其導(dǎo)致過敏的表位以及主要表位中的關(guān)鍵氨基酸尚待確定。
　　本文根據(jù)表位預(yù)測結(jié)果，利用分段表達(dá)的方法，將過敏原TBb的11個表位分成4組，設(shè)計相應(yīng)的引物，通過克隆分別獲得了這4個表位區(qū)段的基因，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。根據(jù)氨基酸序列比對及同源建模的分析結(jié)果，采用定點突變技術(shù)構(gòu)建了表位區(qū)段F2的3個突變體R139A、R141A和D144A。利用Ni2+-NTA親和層析法對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，免疫學(xué)技

4、術(shù)對其進(jìn)行免疫活性鑒定。實驗結(jié)果表明:上述表達(dá)純化的重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示其蛋白純度均大于95％。ELISA和點雜交的結(jié)果表明，表位區(qū)段F2與過敏病人血清IgE具有最強(qiáng)的結(jié)合活性，它可能是TBb的主要表位區(qū)段。氨基酸序列比對及同源建模的分析說明，F(xiàn)2中的表位6(IFRVREGDV)含有一些已經(jīng)識別或者具有結(jié)構(gòu)同源性的氨基酸。對F2及其突變體進(jìn)行的免疫活性實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型的F2相比，R141A具有比R139A和D144A更