乙醇酸氧化酶重組畢赤酵母的構(gòu)建及其催化合成乙醛酸工藝條件初步優(yōu)化.pdf

1、乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase，GO)是一種黃素蛋白酶，它以氧作為電子受體，能催化乙醇酸至乙醛酸的氧化反應(yīng)。產(chǎn)物乙醛酸是一種重要的化工中間體，可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、香料、農(nóng)藥等領(lǐng)域。生物法合成乙醛酸具有污染少，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)，因此是很有前途的合成乙醛酸工藝路線。目前生物法合成乙醛酸主要是利用乙醇酸氧化酶將乙醇酸氧化成乙醛酸，同時(shí)利用過氧化氫酶消除反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫，防止產(chǎn)物的進(jìn)一步氧化。本研究目的在于通過構(gòu)建

2、基因工程菌來催化合成乙醛酸，主要內(nèi)容包括GO的畢赤酵母重組菌構(gòu)建、重組菌的發(fā)酵條件、重組菌催化合成乙醛酸條件。 從新鮮菠菜葉中提取總RNA，利用RT—PCR技術(shù)獲得編碼GO基因的cDNA片斷。通過基因重組將GO基因克隆到載體pAO815中，構(gòu)建了胞內(nèi)表達(dá)載體pAO815/GO。重組質(zhì)粒以BglⅡ線性化后電轉(zhuǎn)整合至甲醇營養(yǎng)酵母GS115染色體。胞內(nèi)蛋白采用SDS—PAGE電泳分析，結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的分子量約為40kDa。甲醇誘

3、導(dǎo)重組菌表達(dá)，并對誘導(dǎo)的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的pH為6.0，最佳的表達(dá)時(shí)間為96h，最佳混合碳源為10g/L山梨醇和0.5g/L甲醇。在最佳的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的GO酶活達(dá)到147IU/g濕菌體。 重組畢赤酵母表達(dá)了乙醇酸氧化酶，并且畢赤酵母胞內(nèi)含有過氧化氫酶，所以重組畢赤酵母可以用于合成乙醛酸。采用重組畢赤酵母作催化劑，乙醇酸為原料，對乙醛酸的合成條件進(jìn)行了研究，并優(yōu)化獲得了較佳的工藝條件。結(jié)果表明：在乙醇酸濃度為0.20mo