STOML-2在宮頸癌中的表達及其功能研究.pdf

1、背景
　　 宮頸癌是世界范圍內女性最常見的第三大腫瘤，在我國宮頸癌居女性生殖道惡性腫瘤的首位。在過去的幾十年中，盡管影像學技術、外科手術、化療和放療取得了很大的進步，但是對于復發(fā)轉移癌的病人治療效果依然不盡人意。因此急切需要找到有意義的分子標志，為宮頸癌的診斷治療措施開辟新的途徑。
　　 STOML-2是新近發(fā)現(xiàn)的stomatin家族的一員，在多種惡性腫瘤中高表達，對惡性腫瘤的作用尚不明確。對其功能研究不多，尚處于初步研

2、究階段，有限的研究表明STOML-2具有穩(wěn)定線粒體膜、參與線粒體融合、調節(jié)線粒體離子通道的功能。
　　 目的
　　 分析STOML-2在宮頸癌中的表達及其與臨床病理特征及預后的關系，探討STOML-2在宮頸癌中的生物學功能。
　　 材料和方法
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 宮頸痛細胞株HeLa、SiHa、C33A、Caski、Hcc94，由中山大學腫瘤醫(yī)院實驗研究部631室保存，用加入了10％FBS(

3、Hyclone)的DMEM或1640(Gibco)培養(yǎng)。
　　 2.組織標本
　　 收集中山大學腫瘤醫(yī)院1999年～2005年的宮頸癌標本300例、10例正常宮頸組織標本以及19例宮頸癌患者的新鮮手術標本，包括癌組織及對應的癌旁組織。
　　 3.RT-PCR和Westernblot
　　 在轉錄和翻譯水平檢測STOML-2的表達。
　　 4.免疫組化
　　 采用免疫組化(LSAB)的方法檢

4、測300例宮頸癌組織、10例正常宮頸組織的表達及19例宮頸癌患者癌組織和對應癌旁組織的表達。
　　 5.siRNA的設計
　　 應用siRNA設計軟件初篩出9對siRNA，再通過BLAST分析剔除與其他編碼基因有同源性的siRNA，最后經(jīng)RNA結構分析軟件分析將對應的基因序列位于二級結構的siRNA去掉，選出三條對靶向STOML-2的siRNA。
　　 6.瞬時轉染宮頸癌HeLa、HCC94細胞
　　 采

5、用脂質體轉染技術將STOML-2-siRNA轉染HeLa、HCC94細胞，轉染48小時后進行相應檢測。
　　 7.Western-blot檢測干擾后STOML-2的蛋白表達水平
　　 8.AnnexinV-FITC/PI、TUNEL法檢測細胞凋亡情況
　　 9.統(tǒng)計學方法
　　 采用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（(-x)±s）表示。STOML-2在宮頸癌組織中的表達及STOML-2

6、與宮頸癌癌各臨床病理因素的相互關系采用x2檢驗。采用Logistic回歸模型分析盆腔淋巴結轉移的危險因素。采用Kaplan-Meier法，Log-Rank檢驗比較生存曲線的差異。采用Cox比例風險模型分析影響生存預后的因素。采用獨立樣本t檢驗比較凋亡實驗各組間差異。各檢驗過程均以P＜0.05(雙側檢驗)認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1.STOML-2在宮頸癌細胞株中高表達
　　 宮頸痛細胞株HeLa、

7、SiHa、C33A、Caski、Hcc94中STOML-2在轉錄和翻譯水平表達高于正常對照組織。
　　 2.STOML-2在宮頸癌組織中高表達
　　 在19對宮頸癌病人組織中，癌組織的STOML-2在轉錄和翻譯水平都比對應的癌旁組織表達高，比值都在2倍以上。
　　 3.STOML-2在宮頸癌中高表達且與SCCA、深肌層浸潤、淋巴脈管浸潤、盆腔淋巴結轉移相關，是獨立的預后因子。SCCA與STOML-2是盆腔淋巴結轉

8、移的高危因素。
　　 STOML-2的高表達與宮頸癌的SCCA(x2=9.014，P=0.003)、深肌層浸潤（x2=5.321，P=0.021）、淋巴脈管浸潤（x2=4.050，P=0.044）、盆腔淋巴結轉移情況(x2=38.668，P＜0.001)相關。STOML-2的陽性表達與其年齡、性別、Figo分期、腫瘤大小、病理分類、病理分級、宮旁浸潤無顯著相關性。Logistic回歸模型多因素分析顯示治療前SCCAg≧1.5ng

9、ml(P＜0.001，OR=5.361)、STOML-2表達(P＜0.001，OR=6.810)為盆腔淋巴結轉移獨立的危險因素。Kaplan-Meier法分析5年生存曲線，STOML-2低表達的宮頸癌患者5年生存率為92％，而STOML-2高表達的宮頸癌患者5年生存率僅為78％，STOML-2低表達組的總體生存率優(yōu)于STOML-2高表達組，統(tǒng)計學上（Log-Rank檢驗）有顯著性差異(x2=11.615,P=0.001)，且隨著STOM

10、L-2表達的增強，總體生存曲線有逐漸下降的趨勢。COX回歸分析顯示STOML-2表達對預后有影響(P=0.001,RR=3.881)。
　　 4.RNAi沉默STOML-2表達后，對細胞生物學功能的影響
　　 RNA干擾48小時后，使用順鉑誘導HeLa、HCC94細胞凋亡，當達到半數(shù)細胞死亡時，行TUNEL法、AnnexinV法檢測。結果顯示，STOML-2被沉默后，HeLa、HCC94細胞的凋亡數(shù)增多，結果有統(tǒng)計學差異

11、。
　　 結論
　　 1.STOML-2在宮頸癌細胞株、癌組織中高表達且與SCCA、深肌層浸潤、
　　 淋巴脈管浸潤、盆腔淋巴結轉移相關，并且是宮頸痛獨立不良預后因子;
　　 2.STOML-2是宮頸癌盆腔淋巴結轉移的獨立危險因素;
　　 3.STOML-2沉默后，HeLa、HCC94細胞株凋亡增多，可能作為一種腫瘤進展基因起作用，其在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抗凋亡作用;
　　 4.S