2A肽介導(dǎo)的三熒光蛋白基因共表達(dá)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因羊中的表達(dá)及其DNA甲基化初步研究.pdf

1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究的發(fā)展,多基因共表達(dá)技術(shù)在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用越來(lái)越重要。目前,常用的多基因共表達(dá)方法有內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件載體、雙向或雙啟動(dòng)子共表達(dá)、多個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染及多病毒載體共感染等。但是這些方法都遇到了多基因共表達(dá)不平衡及表達(dá)量不足的問(wèn)題,如IRES下游基因的表達(dá)對(duì)其在IRES之后的特異定位敏感,有可能造成表達(dá)沉默,或下游蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于同一開(kāi)放閱讀框中上游蛋白的表達(dá)水平。2A肽則能夠改善以上缺陷。2A

2、肽屬于cis-水解酶作用元件(CHYSELs),多基因載體在2A肽調(diào)控下各基因可獨(dú)立表達(dá)。與IRES相比,2A肽序列短(54-90bp)、能夠調(diào)節(jié)多基因獨(dú)立表達(dá)且表達(dá)效率高,具有其它多基因共表達(dá)技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。
　　目前,大多數(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備均以單基因表達(dá)為目標(biāo),而多基因共表達(dá)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究較少。利用2A肽生產(chǎn)多基因修飾動(dòng)物已在小鼠和豬上報(bào)道,但在綿羊上未見(jiàn)報(bào)道。慢病毒載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)是目前家畜生產(chǎn)中效率最高的轉(zhuǎn)基因技術(shù)

3、,2A肽介導(dǎo)的多基因共表達(dá)與慢病毒載體相結(jié)合制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,具有轉(zhuǎn)基因效率高、多基因同時(shí)表達(dá)的特點(diǎn)。在一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物上同時(shí)表達(dá)多個(gè)功能基因,能夠通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)多個(gè)基因協(xié)同作用或多基因聚合作用,提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的利用效率,減少轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)成本,縮短轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)周期。本研究中,我們選用三色熒光蛋白報(bào)告基因(tdTomato、zsYellow1和acGFP1)作為2A肽連接的靶基因,以便于2A肽介導(dǎo)的多基因在細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的觀察和檢測(cè)

4、。首先,將報(bào)告基因tdTomato、zsYellow1和acGFP1與2A肽連接,克隆構(gòu)建了三基因共表達(dá)慢病毒載體(pLEX-2A-TYG);將pLEX-2A-TYG重組慢病毒感染CHO和293T細(xì)胞,在激光共聚焦顯微鏡下觀察三色熒光蛋白的表達(dá);在此基礎(chǔ)上利用慢病毒卵周隙注射方法進(jìn)行綿羊轉(zhuǎn)基因,首次獲得了攜帶三色熒光的轉(zhuǎn)基因綿羊,通過(guò)PCR、Westernblotting、Southernblotting、RealTimeRT-PCR等

5、方法對(duì)轉(zhuǎn)基因整合、多基因表達(dá)及DNA甲基化等進(jìn)行了分析;針對(duì)轉(zhuǎn)基因羊出現(xiàn)的基因表達(dá)沉默現(xiàn)象,通過(guò)DNA甲基化序列分析(BisulfitesequencingPCR,BSP),檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因羊外源基因啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)的甲基化水平,利用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-azaC)和乙?；敢种苿?TSA)分別處理分離的轉(zhuǎn)基因羊成纖維細(xì)胞,對(duì)多基因共表達(dá)轉(zhuǎn)基因羊的DNA甲基化機(jī)制進(jìn)行了探索。本研究主要研究結(jié)果如下:
　　1設(shè)計(jì)并合成了長(zhǎng)為102bp的

6、2A-linker片段。經(jīng)PCR、酶切、克隆,成功構(gòu)建了由2A-linker連接的三色熒光蛋白基因(tdT.omato、zsY.ellow1和acG.FP1)共表達(dá)慢病毒載體(pLEX-2A-TYG)。
　　2利用該重組載體pLEX-2A-TYG轉(zhuǎn)染293T和CHO細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察和Westernblotting檢測(cè)結(jié)果表明,tdTomato、zsYellow1和acGFP1能夠在細(xì)胞中獨(dú)立、高效表達(dá)。
　　3運(yùn)用脂質(zhì)體

7、轉(zhuǎn)染法制備重組慢病毒,將pLEX-2A-TYG質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒pMD2.G和包裝質(zhì)粒pSPAX2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲得了高滴度(3×109IU/ml)重組慢病毒顆粒。將生產(chǎn)的重組慢病毒感染293T和CHO細(xì)胞,Confocal熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示,2A肽介導(dǎo)的三熒光蛋白基因可以在感染細(xì)胞中獨(dú)立高效表達(dá)。
　　4為了檢測(cè)2A肽介導(dǎo)的三色熒光蛋白報(bào)告基因載體是否可以在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá),我們利用慢病毒卵周隙注射技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊。選取供體

8、羊5只,受體羊37只。利用重組慢病毒卵周隙注射獲得可移植轉(zhuǎn)基因胚胎37枚,移植入37只受體母羊中。出生羔羊7只,其中2只(＃6和＃7)經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因羊。
　　5在紫外燈下觀察轉(zhuǎn)基因羔羊耳部、頭部、唇部、蹄部等部位,均沒(méi)有觀測(cè)到熒光。以轉(zhuǎn)基因羔羊尾部皮膚組織為樣本,對(duì)轉(zhuǎn)基因羊中三色熒光蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行Westernblotting及RT-PCR檢測(cè),均未檢測(cè)到三種熒光蛋白。
　　6為了分析造成轉(zhuǎn)基因表達(dá)沉默的原因,

9、我們利用BSP法對(duì)轉(zhuǎn)基因羊尾組織基因組進(jìn)行了甲基化分析。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平為76.25％(＃6)和64.70%(＃7);編碼區(qū)甲基化水平在＃6轉(zhuǎn)基因羊中tdTomato、zsYellow1和acGFP1分別為97.5%、98.1%、和99.2%;＃7羊中tdTomato、zsYellow1和acGFP1分別為97.6%、99.5%和99.6%。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因羊外源基因存在超甲基化現(xiàn)象。我們推測(cè),轉(zhuǎn)基因超甲基化導(dǎo)致了熒光

10、蛋白基因在轉(zhuǎn)基因羊中的表達(dá)沉默。
　　7為了證明DNA超甲基化是否為轉(zhuǎn)基因表達(dá)沉默的原因,我們利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-azaC)和去乙?；敢种苿?TSA)對(duì)分離的轉(zhuǎn)基因羊成纖維細(xì)胞進(jìn)行處理。首先采取2只陽(yáng)性(＃6和＃7)和1只陰性羔羊的尾部皮膚,分離培養(yǎng)了成纖維細(xì)胞,用5-azaC和TSA按不同濃度、不同作用時(shí)間,分別或同時(shí)對(duì)分離的轉(zhuǎn)基因羊成纖維細(xì)胞進(jìn)行處理。經(jīng)熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)分析,結(jié)果顯示,經(jīng)5-azaC和T

11、SA分別處理后,部分成纖維細(xì)胞可見(jiàn)三色熒光的表達(dá),且熒光細(xì)胞比例隨著藥物處理濃度及時(shí)間的增加而增加,兩者呈一定的正相關(guān)。同時(shí),當(dāng)5-azaC和TSA共同作用時(shí),熒光細(xì)胞數(shù)顯著高于5-azaC或TSA單獨(dú)作用時(shí)的熒光細(xì)胞數(shù),表明5-azaC與TSA存在協(xié)同作用。以上結(jié)果表明,細(xì)胞中熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)與DNA甲基化和組蛋白去乙酰化存在明顯關(guān)聯(lián);5-azaC與TSA共同作用時(shí)存在協(xié)同作用。
　　綜上所述,我們利用2A肽介導(dǎo)的多基因共

12、表達(dá)慢病毒載體成功制備了三色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因羊,為未來(lái)多基因共表達(dá)轉(zhuǎn)基因研究提供了新材料。在研究中,我們發(fā)現(xiàn)2A肽介導(dǎo)的多基因共表達(dá)慢病毒載體在體外真核細(xì)胞中能夠獨(dú)立高效表達(dá),但在轉(zhuǎn)基因羊中表達(dá)沉默。轉(zhuǎn)基因羊成纖維細(xì)胞經(jīng)5-azaC和TSA處理后,部分細(xì)胞熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)被激活,提示我們DNA甲基化在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,降低轉(zhuǎn)基因DNA超甲基化水平,規(guī)避轉(zhuǎn)基因表達(dá)沉默,是本實(shí)驗(yàn)