轉(zhuǎn)基因阿爾巴斯白絨山羊外源基因沉默相關(guān)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因沉默(Transgenic Silencing)現(xiàn)象普遍存在于轉(zhuǎn)基因動植物上，因而給轉(zhuǎn)基因動物的培育和應(yīng)用價值帶來了新的難題。目前，學(xué)界對轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究。從所報道的轉(zhuǎn)基因沉默的例子來看，幾乎所有的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象都與外源啟動子的甲基化、組蛋白乙?；惓＜巴庠椿蚩截悢?shù)有關(guān)。在過去5年時間里，本實驗室累計獲得了上百只攜帶報告基因DsRed(Red fluorescence protein from Disc

2、osoma sp.?？t色熒光蛋白)的P0代轉(zhuǎn)基因白絨山羊，其中一部分存在轉(zhuǎn)基因沉默的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象會嚴(yán)重制約轉(zhuǎn)基因動物外源基因的有效表達(dá)，對轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象的機(jī)理進(jìn)行研究，并對其提出可能的解決方案，可以為今后提高轉(zhuǎn)基因動物外源基因的表達(dá)效率提供實驗依據(jù)。
　　本研究從以上轉(zhuǎn)基因白絨山羊中選取了有代表性的6只進(jìn)行研究，培養(yǎng)其耳尖成纖維細(xì)胞，以及一部分表皮來源的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在熒光激發(fā)器激發(fā)下，與對照組相比，在部分成年轉(zhuǎn)基因白

3、絨山羊個體及所采細(xì)胞樣品中均檢測不到紅色熒光，這與CMV啟動子的特性并不相符，表明發(fā)生了轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。
　　經(jīng)過對選取的轉(zhuǎn)基因白絨山羊檢測發(fā)現(xiàn)，其基因組中均具有完整的外源DsRed基因表達(dá)框。實時熒光定量PCR的結(jié)果顯示，僅在編號為ZK110321的個體中DsRed mRNA較其他個體表達(dá)量稍高，但仍低于核供體細(xì)胞CFC3-KI的表達(dá)水平。Western Blot的檢測結(jié)果顯示，只有ZK110324-1個體和CFC3-KI細(xì)胞可

4、以檢測到DsRed蛋白的表達(dá)。并且根據(jù)來自ZK0311-1和ZK110324-1個體的成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的DsRed mRNA表達(dá)量的不同的結(jié)果可以推斷，CMV啟動子在白絨山羊不同組織中的沉默程度有所不同。通過實時熒光定量技術(shù)的絕對定量方法獲得了6只轉(zhuǎn)基因白絨山羊的外源基因拷貝數(shù)，但均與DsRed表達(dá)量無顯著相關(guān)性，排除了外源基因拷貝數(shù)對DsRed基因表達(dá)量的影響。
　　通過重亞硫酸氫鹽測序的方法對轉(zhuǎn)基因白絨山羊進(jìn)行CMV啟動子

5、的甲基化狀態(tài)的研究。本實驗中6只健康轉(zhuǎn)基因白絨山羊和未經(jīng)克隆的核供體細(xì)胞CFC3-KI外源CMV啟動子的甲基化狀態(tài)數(shù)據(jù)顯示，有4只成體轉(zhuǎn)基因白絨山羊的外源基因啟動子處于很高的甲基化狀態(tài)(77.4％-88.2％)有一只處于中等偏高的甲基化狀態(tài)(58.7％)，有一只轉(zhuǎn)基因白絨山羊外源基因啟動子處于較低的甲基化狀態(tài)(21.0％)，未經(jīng)克隆的核供體細(xì)胞甲基化程度很低(14.3％)。將以上數(shù)據(jù)與DsRed基因的表達(dá)情況關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因白絨山

6、羊外源基因的表達(dá)水平與啟動子的甲基化狀態(tài)呈顯著負(fù)相關(guān)。因此外源CMV啟動子的甲基化水平高是外源基因沉默的主要原因。
　　為使轉(zhuǎn)基因白絨山羊細(xì)胞中發(fā)生沉默的外源基因恢復(fù)表達(dá)，本實驗采用了甲基化酶抑制劑5氮雜胞苷(5-Azacytidine，5-Az)和去乙?；敢种苿┣乓志谹(Trichostatin A，TSA)處理的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因白絨山羊細(xì)胞。首先以ZK0311-1和ZK110324-1個體的成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞進(jìn)行了最適藥

7、物濃度的篩選，結(jié)果為:處理成纖維細(xì)胞最適5-Az濃度為5μmol/L，TSA濃度為1μmol/L;處理表皮細(xì)胞的最適5-Az濃度為20μmol/L，TSA濃度為1μmol/L。5-Az的處理時間為7d，TSA的處理時間為24h。之后使用該濃度處理其他轉(zhuǎn)基因白絨山羊耳尖成纖維細(xì)胞后獲得了良好的外源DsRed基因恢復(fù)表達(dá)的效果，經(jīng)5-Az的處理，使ZK110324-2耳尖成纖維細(xì)胞中DsRed mRNA的表達(dá)量提高了50.19倍;經(jīng)TSA的

8、處理，使ZK0311-1耳尖成纖維細(xì)胞中DsRed mRNA的表達(dá)量提高了15.08倍。另對5-Az處理組的6只轉(zhuǎn)基因白絨山羊耳尖成纖維細(xì)胞及核供體細(xì)胞外源CMV啟動子的甲基化水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明ZK0311-1、ZK110324-1和ZK110324-2的耳尖成纖維細(xì)胞CMV啟動子的甲基化水平都有顯著下降，驗證了5-Az降低外源基因啟動子甲基化水平的有效性。在藥物最適濃度篩選實驗中TSA濃度與DsRed mRNA的表達(dá)量與呈劑量依

9、賴型關(guān)系，推斷組蛋白乙酰化異常也是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因白絨山羊外源基因沉默的原因之一。
　　對所獲得的兩只在全身和細(xì)胞水平均未表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因白絨山羊(ZK0310-1和ZK0311-1)耳尖成纖維細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆，經(jīng)過卵母細(xì)胞的綜合重編程作用，紅色熒光在核移植重構(gòu)胚胎中獲得了恢復(fù)表達(dá)。
　　通過以上實驗我們得出:轉(zhuǎn)基因白絨山羊不同個體中外源基因表達(dá)并不相同，甚至發(fā)生外源基因沉默，這與外源基因的CMV啟動子的甲基化以及轉(zhuǎn)基因