MicroRNA-520b調(diào)節(jié)乳腺癌細胞免疫逃逸作用和分子機制的研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼蛋白的短序列RNA片段,長度大約為21～23個核苷酸。研究表明miRNAs參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等諸多過程,最近研究發(fā)現(xiàn)microRNA-520b(miR-520b)與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。CD46,CD55和CD59是一簇膜結(jié)合補體調(diào)節(jié)蛋白(mCRPs),在補體級聯(lián)反應(yīng)中可以通過抑制C5轉(zhuǎn)化酶阻止膜攻擊復(fù)合物(MAC)在腫瘤細胞表面的形成,抑制了補體介導(dǎo)的細胞毒(complement-depe

2、ndent cytotoxicity,CDC)作用,保護腫瘤細胞免受補體攻擊。但是,調(diào)節(jié)CRP的分子機制尚不清楚,miR-520b是否參與了補體介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸也未見報道。為了闡明乳腺癌細胞中調(diào)節(jié)mCRPs的分子機制,我們研究了miR-520b或miR-520e在乳腺癌細胞中參與免疫調(diào)節(jié)的作用,研究應(yīng)用不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細胞系MCF-7和LM-MCF-7(獲國家發(fā)明專利,ZL.0310107316)探討了miR-520b與CRP的關(guān)

3、系及其分子調(diào)控機制,主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.miR-520b和miR-520e靶向CD46影響補體介導(dǎo)的細胞毒作用及其分子機制研究
　　 本實驗室前期通過對肝癌細胞與正常肝細胞的microRNA芯片分析發(fā)現(xiàn),microRNA-520b在肝癌細胞中下調(diào)。為了進一步研究microRNA-520b及與其高度同源的miR-520e在乳腺癌細胞中的作用及其與補體介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸的關(guān)系,我們首先應(yīng)用實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反

4、應(yīng)(quantitative RT-PCR)的方法檢測分析了miR-520b和miR-520e在正常的乳腺細胞HBL-100以及三株乳腺癌細胞系MCF-7,LM-MCF-7和MDA-MB-231細胞系中的表達水平,實驗結(jié)果表明,與正常的乳腺細胞HBL-100相比,乳腺癌細胞MCF-7，LM-MCF-7和MDA-MB-231細胞系中miR-520b和miR-520e的基因表達均下調(diào)。我們進一步在8例正常乳腺組織和7例乳腺癌組織臨床標本中比

5、較了miR-520b的表達水平,發(fā)現(xiàn)miR-520b在乳腺癌組織中的表達水平與正常乳腺組織中的表達水平相比顯著下調(diào),并發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞系抵抗CDC的能力均高于正常乳腺細胞。為了進一步研究miR-520b或miR-520e在乳腺癌細胞中對補體依賴的細胞毒作用的影響,我們外源轉(zhuǎn)染了合成的miR-520b或miR-520e的成熟體(mimics),以及miR-520b或miR-520e的抑制子(anti-mimics).CDC實驗表明,在MCF

6、-7或MDA-MB-231乳腺癌細胞系中過表達miR-520b或miR-520e均可增強CDC的作用,而在干擾了miR-520b或miR-520e的乳腺癌細胞中則抑制了其對CDC的敏感性。綜上結(jié)果表明,miR-520b和miR-520e參與了乳腺癌細胞中補體介導(dǎo)的免疫抑制作用。
　　 為進一步闡明miR-520b和miR-520e在乳腺癌細胞中參與補體介導(dǎo)的免疫抑制的分子機理,我們應(yīng)用生物信息學(xué)軟件在TargetScan和DIA

7、NA microT3.0預(yù)測microRNA靶基因的數(shù)據(jù)庫中對miR-520b和miR-520e的靶基因進行了預(yù)測篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-520b和miR-520e均可以靶向與補體激活級聯(lián)調(diào)節(jié)有關(guān)的靶基因--膜輔助因子(membrane co-factor,MCP,CD46)。本研究發(fā)現(xiàn)在MCF-7乳腺癌細胞中分別過表達miR-520b或miR-520e成熟體可以下調(diào)CD46蛋白質(zhì)表達水平,但不能影響CD46 mRNA轉(zhuǎn)錄水平；當分別過

8、表達miR-520b或miR-520e的抑制子時可見CD46蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)。這一結(jié)果表明CD46是miR-520b和miR-520e兩者共同的靶基因。同時也提示miR-520b和miR-520e可能是通過結(jié)合CD463’非翻譯區(qū)(3’UTR)抑制其翻譯調(diào)控CD46蛋白質(zhì)表達。為了進一步證明這個假設(shè),我們克隆了CD463’UTR miR-520b和miR-520e結(jié)合區(qū)并構(gòu)建了報告基因載體。報告基因結(jié)果表明miR-520b和miR-5

9、20e可以直接靶向結(jié)合CD463’UTR相應(yīng)的結(jié)合區(qū)。ELISA結(jié)果表明,在乳腺癌細胞中過表達miR-520b或miR-520e可以增加補體成分C3b在腫瘤細胞上的積累,從而激活補體級聯(lián)反應(yīng)途徑,促進CDC對腫瘤細胞的裂解作用。以上研究闡明乳腺癌細胞中miR-520b和miR-520e均可直接靶向CD46影響補體介導(dǎo)的細胞毒作用。
　　 2.miR-520b靶向HBXIP影響補體介導(dǎo)的細胞毒作用及其分子機制研究
　　 我

10、們前期發(fā)現(xiàn)HBXIP在腫瘤細胞中促進增殖、抑制凋亡等方面發(fā)揮重要作用。本研究中我們探討了HBXIP在乳腺癌細胞中對CDC的作用。我們首先檢測了HBL-100,MCF-7,LM-MCF-7和MDA-MB-231細胞系中HBXIP的表達水平,發(fā)現(xiàn)三株乳腺癌細胞系HBXIP的表達水平均高于HBL-100細胞系,并發(fā)現(xiàn)HBXIP的表達水平與膜結(jié)合補體調(diào)節(jié)蛋白(mCRPs)的主要成員CD46,CD55和CD59的表達水平呈正相關(guān)。因此,我們設(shè)想H

11、BXIP可能與調(diào)節(jié)CD46,CD55和CD59有關(guān)。
　　 報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,在過表達HBXIP基因的乳腺癌細胞系中,CD46,CD59報告基因活性升高,而RNA干擾HBXIP基因后其報告基因活性降低。應(yīng)用Real-time PCR實驗檢測發(fā)現(xiàn)過表達HBXIP可以上調(diào)CD46,CD55和CD59的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,而在干擾的乳腺癌細胞系CD46,CD55和CD59的mRNA水平下調(diào)。我們進一步發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞系中瞬時過表達或

12、干擾HBXIP可以以劑量依賴的方式上調(diào)或下調(diào)mCRPs的蛋白質(zhì)表達水平。以上結(jié)果表明HBXIP在乳腺癌細胞中可以調(diào)節(jié)CD46,CD55和CD59的表達。
　　 為了進一步闡明HBXIP調(diào)節(jié)mCRPs的分子機制,我們通過報告基因、Western blot分析、免疫熒光染色方法發(fā)現(xiàn)HBXIP在乳腺癌細胞中可以激活NF-κB。雙熒光素酶報告基因以及Western blot分析表明,用NF-κB特異性抑制劑PDTC處理MCF-7-HBX

13、IP乳腺癌細胞后可拮抗CD46,CD55和CD59的表達,當RNA干擾NF-κB活性時也可獲得相似的結(jié)果。上述結(jié)果表明HBXIP可以上調(diào)CD46,CD55和CD59可以通過NF-κB信號通路。我們還發(fā)現(xiàn)HBXIP也可以上調(diào)ERK1/2的磷酸化水平,而對絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)其他兩個成員p38和c-Jun N末端激酶(JNK)的磷酸化水平無影響。發(fā)現(xiàn)磷酸化的ERK1/2也可以上調(diào)CD46,CD55和CD59的表達水平。ERK1/2

14、上游激酶MEK1的特異性抑制劑PD98059也可有效抑制mCRPs的蛋白質(zhì)表達水平。進一步通過Western blot、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪兔庖邿晒馊旧葘嶒炑芯勘砻?ERK1/2的活化可以促進NF-κB的活性,并使其入核,進而促進mCRPs的表達。上述結(jié)果表明,HBXIP可以通過ERK1/2/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)CD46,CD55和CD59的表達水平,進而降低乳腺癌細胞對CDC作用的敏感性,發(fā)揮乳腺癌細胞的免疫逃逸作用。

15、r>　　 為了探討HBXIP上游調(diào)控因子,我們通過TargetScan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)HBXIP為miR-520b的靶基因。于是,我們克隆并且構(gòu)建了含有HBXIP3’UTR的報告基因載體,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炓约?Western blot分析結(jié)果表明miR-520b可以直接結(jié)合HBXIP3’UTR從而抑制HBXIP蛋白質(zhì)的翻譯。表明HBXIP在參與調(diào)節(jié)CDC作用中可以被miR-520b調(diào)控。
　　 綜上所述,本研究通過在乳腺癌細

16、胞中對miR-520b或miR-520e的深入研究,發(fā)現(xiàn)miR-520b或miR-520e在乳腺癌免疫抑制方面發(fā)揮重要的作用,主要闡明了如下分子機制:1)miR-520b或miR-520e通過直接靶向結(jié)合補體調(diào)節(jié)蛋白CD46,影響乳腺癌細胞對補體攻擊的效應(yīng)；2)miR-520b靶蛋白HBXIP可以通過ERK1/2/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)CD46,CD55和CD59的表達水平,進而降低乳腺癌細胞對CDC作用的敏感性,發(fā)揮乳腺癌細胞的免