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文檔簡介
1、目的:腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的因?yàn)?切斷轉(zhuǎn)移途徑對(duì)腫瘤,尤其是晚期腫瘤的治療至關(guān)重要。乳腺癌是威脅女性健康的主要疾病之一,超過80%的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞出現(xiàn)在淋巴管或者血管,最終到達(dá)臨近或者遠(yuǎn)端器官。趨化運(yùn)動(dòng)是細(xì)胞最基本的功能之一,直接參與免疫細(xì)胞歸巢、神經(jīng)發(fā)育、精子運(yùn)動(dòng)受精、傷痕修復(fù)等生命活動(dòng)。最新研究表明,趨化運(yùn)動(dòng)在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的作用。因此,癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白可能成為治療癌癥轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)。
mTORC2(
2、mammalian target of rapamycin complex 2)是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)和細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白激酶復(fù)合體,由mTOR、mLST8、mSin1和Rictor(therapamycin intensitive companion of mTOR)等組成。mTORC2是磷酸化Akt(Ser473)位點(diǎn)的關(guān)鍵蛋白激酶。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),EGF誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)通過PI3K/PDK1/Akt/PKCζ信號(hào)傳導(dǎo)通路,
3、Akt2及其下游底物PKCζ在乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。我們推測(cè)mTORC2可能通過磷酸化Akt而改變PKCら的活性,從而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Rietor是定義mTORC2的核心成分,也是mTORC2發(fā)揮蛋白激酶活性的關(guān)鍵蛋白。
我們以乳腺癌細(xì)胞為例,以Rietor作為目標(biāo)蛋白,應(yīng)用體內(nèi)外相結(jié)合的方法探討Rietor與PKCら之間的相互作用,以及Rictor在癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用。
方法
4、:
1)免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)Rictor在浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá);
2)質(zhì)粒和StealthTMRNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法降低Rictor在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞及T47D細(xì)胞的表達(dá),通過WesternBlotting和RT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證;同時(shí)應(yīng)用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rictor對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響;并檢測(cè)Rictor降表達(dá)對(duì)Akt磷酸化的影響;
3)趨化實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和黏
5、附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rictor降表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和T47D細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響,同時(shí)用WesternBlotting對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行探討;
4)利用熒光顯微鏡技術(shù)和免疫共沉淀檢測(cè)和觀察Rictor和PKCら在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中是否存在相互作用,同時(shí)WesternBlotting檢測(cè)Rictor降表達(dá)對(duì)PKCら活性的影響;
5)熒光顯微鏡技術(shù)和WesternBlotting檢測(cè)Ricto
6、r降表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞actin聚合能力的影響;
6)SCID小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究Rictor降表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞種植瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響。
結(jié)果:
1)Rictor在乳腺癌癌組織中表達(dá)增高,并且Rictor高表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān);
2)Rictor降表達(dá)抑制EGF誘導(dǎo)的Akt(Ser473)位點(diǎn)激活,且對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用;<
7、br> 3)Rictor降表達(dá)顯著抑制EGF誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附能力;
4)Rictor與PKCζ在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用并共定位于遷移細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的前緣,Rictor通過磷酸化PKCζ的活化;
5)Rictor降表達(dá)抑制EGF誘導(dǎo)的actin聚合;
6)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明Rictor降表達(dá)可以抑制SCID小鼠乳腺癌種植瘤的生長和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移。
結(jié)論:
我
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