Rictor與PKCζ相互作用及調(diào)節(jié)乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、目的:腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的因為,切斷轉(zhuǎn)移途徑對腫瘤,尤其是晚期腫瘤的治療至關(guān)重要。乳腺癌是威脅女性健康的主要疾病之一,超過80％的轉(zhuǎn)移癌細胞出現(xiàn)在淋巴管或者血管,最終到達臨近或者遠端器官。趨化運動是細胞最基本的功能之一,直接參與免疫細胞歸巢、神經(jīng)發(fā)育、精子運動受精、傷痕修復(fù)等生命活動。最新研究表明,趨化運動在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的作用。因此,癌細胞運動調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白可能成為治療癌癥轉(zhuǎn)移的靶點。
　　 mTORC2(

2、mammalian target of rapamycin complex 2)是調(diào)節(jié)細胞骨架重構(gòu)和細胞增殖的關(guān)鍵蛋白激酶復(fù)合體,由mTOR、mLST8、mSin1和Rictor(therapamycin intensitive companion of mTOR)等組成。mTORC2是磷酸化Akt(Ser473)位點的關(guān)鍵蛋白激酶。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),EGF誘導(dǎo)的乳腺癌細胞趨化運動通過PI3K/PDK1/Akt/PKCζ信號傳導(dǎo)通路,

3、Akt2及其下游底物PKCζ在乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。我們推測mTORC2可能通過磷酸化Akt而改變PKCら的活性,從而調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。Rietor是定義mTORC2的核心成分,也是mTORC2發(fā)揮蛋白激酶活性的關(guān)鍵蛋白。
　　 我們以乳腺癌細胞為例,以Rietor作為目標蛋白,應(yīng)用體內(nèi)外相結(jié)合的方法探討Rietor與PKCら之間的相互作用,以及Rictor在癌細胞運動和癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 方法

4、:
　　 1)免疫組織化學(xué)染色方法檢測Rictor在浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達；
　　 2)質(zhì)粒和StealthTMRNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法降低Rictor在乳腺癌MDA-MB-231細胞及T47D細胞的表達,通過WesternBlotting和RT-PCR方法進行驗證；同時應(yīng)用MTT法和流式細胞術(shù)檢測Rictor對乳腺癌細胞增殖的影響；并檢測Rictor降表達對Akt磷酸化的影響；
　　 3)趨化實驗、劃痕實驗和黏

5、附實驗檢測Rictor降表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞和T47D細胞運動能力的影響,同時用WesternBlotting對其分子機制進行探討；
　　 4)利用熒光顯微鏡技術(shù)和免疫共沉淀檢測和觀察Rictor和PKCら在乳腺癌MDA-MB-231細胞中是否存在相互作用,同時WesternBlotting檢測Rictor降表達對PKCら活性的影響；
　　 5)熒光顯微鏡技術(shù)和WesternBlotting檢測Ricto

6、r降表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞actin聚合能力的影響；
　　 6)SCID小鼠體內(nèi)實驗研究Rictor降表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞種植瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1)Rictor在乳腺癌癌組織中表達增高,并且Rictor高表達與乳腺癌細胞淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；
　　 2)Rictor降表達抑制EGF誘導(dǎo)的Akt(Ser473)位點激活,且對乳腺癌細胞增殖有明顯的抑制作用；<

7、br>　　 3)Rictor降表達顯著抑制EGF誘導(dǎo)的乳腺癌細胞趨化運動、細胞遷移和細胞黏附能力；
　　 4)Rictor與PKCζ在細胞內(nèi)存在相互作用并共定位于遷移細胞運動的前緣,Rictor通過磷酸化PKCζ的活化；
　　 5)Rictor降表達抑制EGF誘導(dǎo)的actin聚合；
　　 6)體內(nèi)實驗證明Rictor降表達可以抑制SCID小鼠乳腺癌種植瘤的生長和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論:
　　 我