BMP9通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞相互作用抑制乳腺癌的研究.pdf

1、目的：
　　將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231與前體脂肪細(xì)胞3T3-L1共培養(yǎng)來(lái)模擬乳腺脂肪微環(huán)境,從體內(nèi)和體外兩個(gè)方面研究人類骨形態(tài)發(fā)生蛋白9對(duì)乳腺脂肪微環(huán)境中乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移的影響及其可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　以惡性程度較高的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞作為研究對(duì)象,將重組腺病毒AdBMP9 (以AdGFP作為對(duì)照)及干擾腺病毒AdsiBMP9(以AdRFP作為對(duì)照)感染MDA-MB

2、-231細(xì)胞,構(gòu)建重組MDA-MB-231/AdBMP9過(guò)表達(dá)細(xì)胞株(MDA-MB-231/AdGFP為對(duì)照細(xì)胞)及重組MDA-MB-231/AdsiBMP9干擾細(xì)胞株(MDA-MB-231/AdRFP為對(duì)照細(xì)胞),分別與前體脂肪細(xì)胞3T3-L1在Transwell體系中間接共培養(yǎng)3 d。
　　實(shí)驗(yàn)分組如下：
　　①M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞+3T3-L1細(xì)胞共培養(yǎng)作為空白組,以Co-Blank表示；
　　②MDA-MB

3、-231/AdGFP細(xì)胞+3T3-L1細(xì)胞共培養(yǎng)作為過(guò)表達(dá)對(duì)照組,以Co-AdGFP表示；
　?、跰DA-MB-231/AdRFP細(xì)胞+3T3-L1細(xì)胞共培養(yǎng)作為干擾對(duì)照組,以Co-AdRFP表示；
　?、躆DA-MB-231/AdBMP9細(xì)胞+3T3-L1細(xì)胞共培養(yǎng)作為過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組,以Co-AdBMP9表示；
　?、軲DA-MB-231/AdsiBMP9細(xì)胞+3T3-L1細(xì)胞共培養(yǎng)作為干擾實(shí)驗(yàn)組,以Co-AdsiBM

4、P9表示。針對(duì)共培養(yǎng)體系中的MDA-MB-231細(xì)胞：RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)其BMP9的過(guò)表達(dá)及干擾情況；通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其增殖能力；Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移能力的變化；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)其周期變化；免疫熒光檢測(cè)其瘦素受體(OB-R)的表達(dá)；蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)其瘦素(leptin)、瘦素長(zhǎng)受體(OB-Rb)及短受體(OB-Rt)和leptin信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)情況。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)體系

5、中前體脂肪細(xì)胞3T3-L1的leptin表達(dá)水平;ELISA技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液中的leptin分泌水平。將前體脂肪細(xì)胞分別與各重組乳腺癌細(xì)胞以2.5×107：5×106/鼠的比例混合后,通過(guò)皮下注入裸鼠的體內(nèi),進(jìn)行皮下成瘤。每隔5天測(cè)定一次瘤體大小,21天后將裸鼠處死,留取瘤組織做HE染色觀察瘤體分化情況；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)瘤體中l(wèi)eptin、c-Myc、CyclinD1、MMP9、p-ERK1/2、p-STAT3的表達(dá)情況。
　　

6、結(jié)果：
　?、賀T-PCR及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示BMP9過(guò)表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231/AdBM9及BMP9低表達(dá)的干擾細(xì)胞株MDA-MB-231/AdsiBM9構(gòu)建成功；
　?、谂c3T3-LI細(xì)胞共培養(yǎng)后,針對(duì)乳腺癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MTT結(jié)果顯示BMP9過(guò)表達(dá)組(Co-AdBMP9)的細(xì)胞增殖較對(duì)照組受到明顯抑制(P0.05),Co-AdsiBMP9組的細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組明顯升高(P0.05)；流式細(xì)胞術(shù)(F

7、CM)檢測(cè)結(jié)果表明Co-AdBMP9組的細(xì)胞周期阻滯于G2/M期(P0.05)；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)48h后Co-AdBMP9組劃痕愈合率較對(duì)照組顯著降低(P0.05),而Co-AdsiBMP9組劃痕愈合率較對(duì)照組明顯升高(P0.05)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示24h后Co-AdBMP9組乳腺癌細(xì)胞穿膜數(shù)顯著低于對(duì)照組(P0.05),而Co-AdsiBMP9組腫瘤細(xì)胞穿膜數(shù)顯著高于對(duì)照組(P0.05)；免疫熒光結(jié)果顯示乳腺癌MDA-M

8、B-231細(xì)胞瘦素受體OB-R表達(dá)陽(yáng)性。Western blotting結(jié)果表明leptin、OB-Rb、OB-Rt表達(dá)水平在Co-AdBMP9、Co-AdsiBMP9組與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化(P0.05)；Western blotting檢測(cè)瘦素信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況,結(jié)果顯示Co-AdBMP9組p-ERK1/2、p-STAT3的表達(dá)明顯降低(P0.05),Co-AdsiBMP9組與對(duì)照組相比明顯升高(P0.05),但Co-AdB

9、MP9組和Co-AdsiBMP9組p-Akt的表達(dá)均無(wú)明顯變化(P0.05)：同時(shí),Co-AdBMP9組leptin信號(hào)通路下游靶因子c-Myc、CyclinD1、MMP9、VEGF的表達(dá)明顯降低(P0.05),Co-AdsiBMP9組與對(duì)照組相比明顯升高(P0.05)。
　?、踂estern blotting結(jié)果顯示前體脂肪細(xì)胞3T3-L1的leptin表達(dá)水平在Co-AdBMP9組顯著下調(diào)(P0.05),而Co-AdsiBMP

10、9組leptin的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯升高(P0.05)；ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)Co-AdBMP9組的leptin分泌量與對(duì)照組相比明顯降低(P0.05),而Co-AdsiBMP9組與對(duì)照組相比明顯升高(P0.05)；
　?、軇?dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Co-AdBMP9組的皮下瘤體積明顯比對(duì)照組小(P0.05),而Co-AdsiBMP9組瘤體明顯增大于對(duì)照組(P0.05)；HE染色結(jié)果顯示Co-AdBMP9組腫瘤細(xì)胞分化較對(duì)照組高,而Co

11、-AdsiBMP9組腫瘤細(xì)胞的分化程度比照組低；免疫組縱化學(xué)梁色表明Co-AdBMP9組leptin、c-Myc、CyclinD1、MMP9、p-ERK1/2和p-STAT3的染色強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組,而Co-AdsiBMP9組的染色強(qiáng)度明顯比對(duì)照組高。結(jié)論在體內(nèi)外模擬乳腺脂肪微環(huán)境中,BMP9可以通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞的相互作用,從而抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和遷移。其可能的機(jī)制為：BMP9抑制前體脂肪細(xì)胞3T3