血管內皮祖細胞在兔腰椎終板下缺血區(qū)歸巢與療效的實驗研究.pdf

1、腰椎退行性變是常見病和多發(fā)病，其病因復雜。目前眾多的研究認為椎間盤退變與終板下微循環(huán)障礙密切相關。終板下微循環(huán)障礙引起的局部缺血性改變，影響了營養(yǎng)物質透過終板對椎間盤的供應，最終導致椎間盤退變。如能在終板下椎體的缺血階段進行及時治療，改善局部微循環(huán)，便有可能預防或延緩椎間盤退變的發(fā)生。因此研究如何改善終板下微循環(huán)從病因上防治椎間盤退變有重要的臨床意義。血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPC)是血

2、管內皮細胞(endothelial cells，EC)的前體細胞，具有較強的增殖和分化能力，在缺血區(qū)域歸巢后能形成新生的血管。EPC已在心肌及下肢等缺血性疾病的基礎研究和初步臨床應用中顯示出重要的治療價值，有廣闊的臨床應用前景。但目前尚未見EPC用于治療腰椎退性變疾病的研究。
　　 本研究首先采用經(jīng)皮穿刺兔腰椎終板下椎體注射平陽霉素的方法破壞終板下微循環(huán)，造成終板下缺血動物模型，觀察椎間盤退變過程。MRI及病理驗證顯示動物模型穩(wěn)

3、定、可靠；通過兔腰動脈數(shù)字減影血管造影(DSA)和血管鑄型的對照研究，分析兔腰椎椎體及椎間盤血供的來源，可為今后經(jīng)腰動脈選擇性插管給藥或細胞治療提供指導。將終板下缺血動物模型骨髓來源的EPC,在體外CM-DiI熒光標記后自體移植，分為腰動脈和耳緣靜脈兩種移植途徑，術后觀察EPC在終板下缺血椎體的歸巢、分化和血管生成情況，比較兩種移植途徑對防治椎間盤退變的療效差異。初步探討EPC移植治療終板下椎體缺血防治椎間盤退變的可行性。本研究分為三個

4、部分：
　　 第一章：兔腰椎終板下缺血模型的制作及腰動脈造影與血管鑄型研究。
　　 目的：評價經(jīng)皮穿刺兔腰椎終板下椎體，注射平陽霉素制作椎體終板下缺血模型的可行性；通過兔腰動脈血管鑄型與造影的對照研究，探討椎體及椎間盤的血供來源。
　　 方法：選取42只新西蘭大白兔，每兔設第5腰椎(L5)為實驗組、第4腰椎(L4)為自身對照組。穿刺腰椎終板下椎體，L5注射平陽霉素(2 mg/mL)1 mL，L4注射生理鹽水1 m

5、L。術后第1、2、3、4、5周、2月及3月隨機選取6只行MRI檢查，并取病理送檢。測量對比第4周實驗組MRI與病理切片的缺血面積。另選6只兔行腰動脈造影和血管鑄型，測量腰動脈及其分支的長度和直徑。
　　 結果：對照組MRI和病理學檢查均無特異性變化，實驗組MRI和病理第1～2周變化不明顯，第3周出現(xiàn)FST1WI低信號，T2WI及FST2WI呈稍高信號，第4周信號變化更明顯；第3～4周病理骨小梁排列雜亂，骨細胞逐漸減少，椎體骨髓內

6、血細胞減少，脂肪細胞增多融合，終板軟骨細胞減少、結構紊亂，纖維環(huán)及髓核無明顯變化；第5周出現(xiàn)椎間盤退變表現(xiàn)，第2、3月終板下椎體缺血持續(xù)存在、椎間盤退變更加明顯。實驗組第4周MRI與病理切片缺血面積之間有顯著正相關性(r=0.965,P＜0.001)。腰動脈DSA與血管鑄型可以清楚顯示腰動脈的達3級分支水平，兩者對比研究顯示測量結果具有一致性(t檢驗，P＞0.05)。
　　 結論采用經(jīng)皮穿刺終板下椎體注射平陽霉素的方法可成功制作

7、兔腰椎終板下缺血動物模型，具有創(chuàng)傷小、操作簡便、重復性好和成功率高的特點。該模型是研究腰椎及椎間盤退變較理想的一種動物模型。腰動脈DSA與血管鑄型研究顯示，腰動脈支干內側支是兔腰椎體及椎間盤的血供來源，這可以指導經(jīng)腰動脈途徑細胞治療或插管給藥。
　　 第二章：兔骨髓來源血管內皮祖細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性鑒定。
　　 目的：建立新西蘭大白兔骨髓來源的內皮祖細胞(EPC)分離、培養(yǎng)、誘導分化與鑒定的方法，并探討其生物學特性

8、，為EPC移植防治椎間盤退變提供前期實驗基礎。
　　 方法：穿刺收集終板下椎體缺血模型兔的股骨及脛骨骨髓24例，單核細胞采用密度梯度離心法分離，接種在纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng)。以EGM-2培養(yǎng)基誘導擴增EPC。EPC的鑒定：DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I熒光雙標記、流式細胞術；EPC向血管內皮細胞(EC)分化的能力采用透射電鏡和管腔形成實驗予以鑒定。
　　 結果：分離的EPC培養(yǎng)72小時可見貼壁細胞形

9、成明顯克隆集落，培養(yǎng)7天見克隆集落數(shù)目增加，9天的細胞融合度約達85％，第13天時見細胞排列呈鋪路石樣。培養(yǎng)至第7天細胞Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I雙熒光染色陽性率為(86.4±4.0)％，CD133、CD34及KDR標記陽性率分別為(20.3±3.2)％、(48.3±5.2)％及(62.4±4.2)％。第14天CD133、CD34及KDR標記陽性率分別為(3.6±3.8)％、(35.6±2.4)％及(86.5±6.3)％

10、，CD133、CD34及KDR陽性率的前后比較，有顯著意義(t檢驗，P＜0.05)。培養(yǎng)第10天的EPC透射電鏡檢查顯示成熟血管EC特征性結構-Weibel-Palade小體。EPC的管腔形成實驗表明，體外培養(yǎng)7天至12天的EPC具有較強的管腔形成能力。
　　 結論：采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)的兔骨髓來源的單個核細胞在特定誘導條件下可分化為EPC，純度較高，穩(wěn)定性和重復性較好。體外培養(yǎng)7天至12天的EPC具有良好的管

11、腔形成能力。
　　 第三章：經(jīng)不同途徑移植CM-DiI標記的兔血管內皮祖細胞在腰椎終板下缺血區(qū)的歸巢及療效研究。
　　 目的：經(jīng)兔腰動脈和耳緣靜脈途徑自體移植CM-DiI標記的EPC，探討EPC在兔在終板下椎體缺血的歸巢情況與治療效果。
　　 方法：分次抽取48只模型兔的骨髓并分離出EPC，培養(yǎng)至7天的貼壁細胞以CM-DiI熒光標記計數(shù)。48只抽髓兔隨機分為經(jīng)腰動脈移植組(A組，n=24)和經(jīng)耳緣靜脈移植組(B組

12、，n=24)，未抽髓模型兔設為空白對照組(C組，n=18)。每兔自體移植的EPC數(shù)量4×106。A、B組術后7天，1月熒光顯微鏡下觀察EPC在終板下缺血區(qū)的歸巢與血管生成情況，術后1、2及3月行腰椎MRI檢查，測量三組終板下椎體缺血區(qū)的血管計數(shù)變化并做統(tǒng)計學比較。
　　 結果：A組術后7天見呈紅色熒光標記的EPC在終板下椎體缺血區(qū)歸巢、1月可見局部血管形成；1月至3月缺血區(qū)血管計數(shù)增多，MRI示EPC移植后缺血區(qū)信號逐漸恢復正常

13、，椎間盤未見退變表現(xiàn)；B、C組則未見EPC歸巢，血管計數(shù)逐漸減少，MRI示終板下椎體缺血信號逐漸明顯，對應椎間盤逐漸退變。EPC移植1、2及3月三組的血管計數(shù)的單因素ANOVA：A組1、2、3月組內比較，F(xiàn)=34.887，不同時間點的三組間比較：1月F=40.724，2月F=157.343，3月F=267.234，均P＜0.05(單因素ANOVA)。以上結果進一步以LSD法行兩兩多重比較的結果：A組的1月與2月、1月與3月、2月與3月比