CD74基因轉染對人臍靜脈內皮細胞ECV304特性的影響.pdf

1、CD74即MHC-Ⅱ類分子相關恒定鏈(major histocompatibility complexⅡ-associated invariant chain，Ii)，主要表達于樹突狀細胞、單核巨噬細胞、B細胞等抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，是在內質網中與新合成MHC-Ⅱ類分子連接在一起形成九聚體的輔助分子，屬Ⅱ型膜分子，與抗原提呈功能有關。近來研究還發(fā)現CD74可做為巨噬細胞移動抑制因子的受

2、體，與相應細胞因子結合激活NF-κB和ERK1/2信號轉導途徑，進而誘導炎性細胞因子的分泌；研究還發(fā)現，CD74除了表達于抗原提呈細胞，與抗原提呈有關外，CD74分子還在內皮細胞、腫瘤細胞表達，與相應疾病的發(fā)生、發(fā)展有關。
　　 血管內皮細胞是位于血管內壁的單層細胞，具有分泌血管活性物質、參與炎癥細胞和免疫細胞游走、維持血管舒縮等多方面生物學功能。臍靜脈內皮細胞因具有人體血管內皮細胞的基本特性，且新生兒臍帶來源充足、取材容易、操

3、作方便，而成為血管內皮細胞體外研究的主要材料。ECV304是常用的人臍靜脈內皮細胞，也是研究內皮細胞生物學特性與疾病相關性的重要手段。本文將CD74基因轉染ECV304細胞，旨在探討CD74基因在HUVEC的轉染條件和CD74基因轉染對細胞特性及功能的影響，為深入研究基于調節(jié)CD74表達的生物治療打下基礎。
　　 研究方法
　　 1)將含有CD74 cDNA的pCMV-CD74 EGFP熒光質粒通過轉化大腸桿菌進行擴增、

4、質粒提取、并經酶切和測序進行鑒定：
　　 2)將pCMV-CD74質粒轉染臍靜脈內皮細胞ECV304，通過EGFP熒光質粒對ECV304細胞進行轉染率的檢測；
　　 3)pCMV-CD74質粒轉染前后ECV304細胞CD74 mRNA和CD74分子表達的鑒定：采用免疫組化法和Western blot，檢測轉染前后ECV304細胞CD74分子的表達；采用Real-time RT-PCR法檢測轉染后CD74 mRNA水平的表

5、達；
　　 4)pCMV-CD74質粒轉染前后ECV304細胞功能相關基因(HLA-A、HLA-DR、IFNGR)表達的檢測：采用Real-time RT-PCR比較轉染前后臍靜脈內皮細胞各功能相關基因的表達；
　　 5)應用Real-time RT-PCR分析軟件分析實驗數據。
　　 結果：
　　 1)在大腸桿菌擴增后提取的質粒經EcorI單酶切，電泳顯示pCMV-CD74質粒線性大小約4.7kb; E

6、corI和XbalI雙酶切可見大小約1.35kb的基因片段，與CD74 cDNA全長(1.327kb)大小符合，并經測序分析符合CD74基因序列：
　　 2)熒光顯微鏡觀察轉染后綠色熒光蛋白的表達情況，并且經過計算得出脂質體介導的轉染率是65.8％；
　　 3)免疫組化結果顯示，轉染后，ECV304細胞CD74表達增強；Real-timeRT-PCR結果顯示，實驗組△Ct值為4.8599，對照組△Ct值為9.2496，2

7、-△△Ct結果為20.9619大于2，有統(tǒng)計學意義，說明轉染后CD74 mRNA表達顯著升高；
　　 4)Real-time RT-PCR結果顯示，轉染前后ECV304細胞HLA-A△Ct值分別為9.4881和12.1097，2-△△Ct為6.1543大于2，說明轉染前后HLA-A表達有顯著差異；IFNGR△Ct值分別為4.9828和5.5228，2-△△Ct為1.4539小于2，轉染前后無顯著差異：HLA-DR△Ct值分別為1