高遷移率族蛋白B1對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化患者Treg-Th17平衡的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究.pdf

1、目的：明確高遷移率族蛋白B1( high mobility group box B1，HMGB1)對(duì)Treg、Th17細(xì)胞凋亡和分化的影響，探討HMGB1影響動(dòng)脈粥樣硬化患者Treg/Th17細(xì)胞失衡的機(jī)制。
　　方法：（1）依據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果及排除標(biāo)準(zhǔn)篩選病例，收集患者肘靜脈抗凝血，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（ peripheral blood mononuclear cell， PBMC）。（2）采用Annexi

2、n-V-FITC單染法檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化組（atherosclerosis，AS）及冠脈造影正常對(duì)照組（normal coronary arteries，NCA）患者PBMC中Treg、Th17細(xì)胞凋亡率。（3）qRT-PCR檢測(cè)AS組及NCA組PBMC中HMGB1基因表達(dá)水平。（4）用重組HMGB1（recombinant HMGB1，rHMGB1）以不同濃度和時(shí)間梯度刺激NCA組PBMC，流式檢測(cè)Treg和Th17細(xì)胞比例變化。（5）

3、用rHMGB1刺激AS組和NCA組PBMC，通過(guò)流式檢測(cè)Treg和Th17細(xì)胞比例和qRT-PCR檢測(cè)Foxp3、RORC mRNA水平，比較rHMGB1對(duì)兩組患者Treg和Th17細(xì)胞影響的差異。（6）用rHMGB1對(duì)NCA組PBMC進(jìn)行細(xì)胞刺激試驗(yàn)，觀察rHMGB1對(duì)Treg和Th17細(xì)胞凋亡的影響。（7）采用免疫磁珠法分選NCA組PBMC中的初始CD4+T細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)來(lái)分析rHMGB1對(duì)Treg和Th17細(xì)胞分化

4、的影響。
　　結(jié)果：（1）AS組Treg細(xì)胞凋亡率顯著高于NCA組（p<0.01），而NCA組和AS組Th17細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異（p>0.05）。（2）AS組PBMC中HMGB1 mRNA水平顯著高于NCA組（p<0.01）?；颊逷BMC中HMGB1 mRNA水平與外周血Treg細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān)（r=0.660，p<0.001）,而與Th17細(xì)胞凋亡水平無(wú)明顯相關(guān)性（r=0.062，p>0.05）。（3）rHMGB1以不同

5、濃度和時(shí)間刺激PBMC使Treg細(xì)胞比例顯著降低，使Th17細(xì)胞比例顯著升高，其中100ng/ml濃度（p<0.01）rHMGB1和24h作用時(shí)間（p<0.01）分別為最佳作用濃度和時(shí)間。（4）相比對(duì)照組，用100ng/ml rHMGB1作用24h后，NCA組和AS組兩組PBMC中Treg細(xì)胞表達(dá)水平（p<0.01）以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA水平均顯著降低（p<0.01），而Th17細(xì)胞表達(dá)水平（p<0.01）以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

6、RORC mRNA水平均顯著升高（p<0.01）。AS組Treg細(xì)胞減少的程度（p<0.01）和Foxp3 mRNA水平降低（p<0.01）的程度均顯著高于NCA組；AS組Th17細(xì)胞增多的程度（p<0.01）和RORC mRNA水平升高的程度（p<0.05）均顯著高于NCA組。（5）rHMGB1刺激使Treg細(xì)胞凋亡率顯著升高（p<0.01），而對(duì)Th17細(xì)胞凋亡水平未產(chǎn)生明顯影響（p>0.05）。（6）NCA組初始CD4+T細(xì)胞在給

7、予細(xì)胞因子等誘導(dǎo)條件之前，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例分別為（1.5±0.45）％和（0.9±0.38）%；當(dāng)初始CD4+T細(xì)胞在TGF-β1和IL-2作用下（對(duì)照組）誘導(dǎo)7天后，CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞中的比例顯著升高至（29.8±1.75）%；當(dāng)初始CD4+T細(xì)胞在IL-1β、IL-6和IL-23作用下（對(duì)照組）誘導(dǎo)7天后，CD4+IL-17+Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞中的比例顯著升高至（8.0

8、±0.84）%。而加入了rHMGB1的處理組中Treg細(xì)胞表達(dá)率為（20.6±1.41）%，顯著低于對(duì)照組（p<0.01）；加入了rHMGB1的處理組中Th17細(xì)胞表達(dá)率為（12.1±0.81）%，顯著高于對(duì)照組（p<0.05）。處理組培養(yǎng)液上清中IL-10濃度顯著低于對(duì)照組（p<0.05）；處理組培養(yǎng)液上清中IL-17A濃度顯著高于對(duì)照組（p<0.01）。
　　結(jié)論：（1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明HMGB1能影響AS患者外周血中Treg/T