HCV NS3-4A絲氨酸蛋白酶表達細胞系和重組細胞凋亡酶-3的構(gòu)建及其應(yīng)用的研究.pdf

1、丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的傳染性疾病，是慢性肝病的主要原因之一。全球范圍內(nèi)HCV感染人數(shù)達1.7億，我國約4000多萬人，HCV感染已成為嚴重的世界公共衛(wèi)生問題之一。迄今尚無疫苗和特異有效的治療藥物。 鑒于蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑在治療HIV方面取得良好療效，以蛋白酶和RNA聚合酶為靶標尋找特異有效的治療藥物已成為HCV感染防治研究的重要方向之一。缺乏可靠的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小動物實驗?zāi)Ｐ?，極大地阻礙了抗HCV藥物的篩選

2、，因此以酶分子為靶位的測定系統(tǒng)常作為藥物篩選的替代系統(tǒng)。由于候選藥物分子必須具有易進入細胞、穩(wěn)定性好等特征，建立一種細胞水平上酶活性的測定系統(tǒng)對于篩選抗HCV藥物無疑有著重要意義。 NS3/4A絲氨酸蛋白酶在多聚蛋白前體加工成熟中起著關(guān)鍵的作用，是抗HCV的主要靶標。鑒于NS3/4A絲氨酸蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)、生化特性和切割水解底物的特征，以及細胞凋亡酶3(caspase-3，簡寫為Casp3)的結(jié)構(gòu)特征和活化方式已經(jīng)明確。本研究依據(jù)

3、Casp3是哺乳動物細胞中重要的凋亡執(zhí)行分子之一，它的活化必然會引起細胞的凋亡。將Casp3中的特異切割位點轉(zhuǎn)換為HCVNS3/4A絲氨酸蛋白酶識別的特異序列，這種改構(gòu)的Casp3(rCasp3)進入表達NS3/4A蛋白酶的細胞內(nèi)可以特異的被切割與活化，從而引起該細胞的凋亡。以細胞凋亡及其引起的活細胞數(shù)量減少等為指標，間接反映NS3/4A蛋白酶的活性，初步建立以MTT為基礎(chǔ)的細胞內(nèi)NS3/4A蛋白酶活性測定系統(tǒng)。本研究分以下四個部分，主

4、要研究結(jié)果如下： 1.表達NS3/4A絲氨酸蛋白酶細胞系的建立從HCV感染患者血清中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，PCR擴增了含有部分NS4A核心區(qū)(21～34aa)與NS3N末端180aa的編碼基因，兩者通過Linker(GRRP)連接，記為NS3/4A；同時以NS3絲氨酸蛋白酶活性缺失突變體為陰性對照。構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pRSETA-NS3/4A及真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-NS3/4A、pcDNA3.1-△NS3

5、/4A。將pRSETA-NS3/4A轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌，IPTG誘導表達后，并用親和層析法進行純化獲得NS3/4A蛋白。將上述兩個真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，通過G418(400μg/ml)壓力選擇，建立了穩(wěn)定表達細胞克隆，分別記為scpHepG2和△scpHepG2。將基因NS3/4A亞克隆入四環(huán)素反應(yīng)性質(zhì)粒pTRE2hyg，構(gòu)建了pTRE2hyg-NS3/4A；用四環(huán)素調(diào)控性質(zhì)粒pTRE-tet-on轉(zhuǎn)染HepG2

6、細胞，篩選出低背景高表達的Tet-onHepG2穩(wěn)定細胞系，進而將pTRE2hyg-NS3/4A轉(zhuǎn)染該細胞，通過潮霉素(200μg/ml)壓力選擇獲得了誘導表達NS3/4A絲氨酸蛋白酶的雙穩(wěn)定細胞系，記為T-NS3/4AHepG2。 2.重組細胞凋亡酶-3的構(gòu)建與表達從Jurkat細胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作模板，PCR擴增Casp3基因；通過重疊PCR方法，將Casp3序列中的切割位點轉(zhuǎn)換為NS3/4A絲氨酸蛋白酶切割

7、序列(NS4A/4B及NS5A/5B連接處)，記為rCasp3；構(gòu)建其真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-rCasp3與原核表達質(zhì)粒(含有蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域PTD)pETPTD-rCasp3；將pETPTD-rCasp3轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，用IPTG誘導表達后，并利用親和層析法得到純化PTD-rCasp3。 3.rCasp3的活化依賴NS3/4A蛋白酶活性的實驗檢測利用脂質(zhì)體法，將pcDNA3.1-rCasp3轉(zhuǎn)染scpHepG2和△

8、scpHepG2細胞。透射電鏡結(jié)果顯示：表達NS3/4A絲氨酸蛋白酶的HepG2細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡現(xiàn)象，而沒有表達NS3/4A絲氨酸蛋白酶或其活性缺失的細胞沒有凋亡。用AnnexinV-PI雙染進行流式細胞術(shù)檢測表明：表達NS3/4A絲氨酸蛋白酶的HepG2細胞組凋亡率約45％，而表達NS3/4A絲氨酸蛋白酶或其活性缺失的細胞組凋亡率很低。臺盼藍染色測定細胞存活情況表明轉(zhuǎn)染NS3/4A絲氨酸蛋白酶的HepG2細胞組細胞存活率明顯低于

9、正常及陰性對照組。以上結(jié)果說明，rCasp3的活化是依賴于NS3/4A絲氨酸蛋白酶的活性，并能夠引起細胞凋亡。 4.以MTT為基礎(chǔ)細胞內(nèi)NS3/4A活性測定系統(tǒng)的建立在上述基礎(chǔ)上，以pcDNA3.1-rCasp3轉(zhuǎn)染scpHepG2細胞或PTD-rCasp3與scpHepG2細胞共同孵育兩種方式，建立了以MTT為基礎(chǔ)的NS3/4A活性測定系統(tǒng)。實驗顯示，無論以何種方式將rCasp3導入scpHepG2細胞，細胞生長都明顯降低；但

10、兩種導入方式，達到最大效應(yīng)的時間點不同，轉(zhuǎn)染法72hOD值達到最低，而轉(zhuǎn)導法是16h；抑制劑預處理scpHepG2細胞組與正常細胞組的細胞生長曲線無顯著性差異。因此，NS3/4A絲氨酸蛋白酶的活性能夠間接被細胞凋亡酶-3的活性所指示。 綜上所述，本研究構(gòu)建并獲得了兩種表達(組成性與可調(diào)控)NS3/4A絲氨酸蛋白酶的細胞系；構(gòu)建了NS3/4A活性特異性識別底物rCasp3(其切割位點用NS3/4A識別序列替換)；一系列實驗驗證了活