穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的重組HBV復(fù)制細(xì)胞系及HBV易感細(xì)胞系的構(gòu)建.pdf

1、HBV引起的慢性乙型病毒性肝炎及其相關(guān)疾病嚴(yán)重危害人類健康。HBV持續(xù)感染是發(fā)展成肝硬化、肝癌的重要危險(xiǎn)因素。加強(qiáng)對(duì)HBV分子生物學(xué)的研究，為指導(dǎo)臨床治療和新藥的發(fā)現(xiàn)提供重要的依據(jù)，同時(shí)將有助于降低HBV的發(fā)病率和死亡率。
　　本研究中，我們通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的重組HBV復(fù)制細(xì)胞系及HBV易感細(xì)胞系，為HBV感染模型的研究及受體抑制劑的研究提供了有利工具。
　　第一部分：穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的重組HBV復(fù)制細(xì)胞系的構(gòu)建

2、r>　　目的：將乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）改造成可以攜帶表達(dá)熒光素酶標(biāo)簽的重組HBV，并且在輔助質(zhì)粒存在時(shí)仍有復(fù)制能力并能形成完整的HBV顆粒。
　　方法：
　　1.應(yīng)用PCR及分子克隆技術(shù)，利用表達(dá)野生型HBV的pTRE-HBV質(zhì)粒，在HBV S區(qū)HBsAg的XhoI-BsrGI區(qū)段表達(dá)熒光素酶secNluc，構(gòu)建帶有SecNluc熒光素酶標(biāo)簽的pTRE-HBV-S-NLuc的重組HBV質(zhì)粒

3、。
　　2.構(gòu)建具有殺稻瘟菌素抗性的HBV輔助質(zhì)粒pcDNA3.1(-)Bsd-CH3142。
　　3.表達(dá)潮霉素抗性的重組HBV質(zhì)粒pTRE-HBV-S-NLuc與表達(dá)殺稻瘟菌素抗性的HBV輔助質(zhì)粒pcDNA3.1(-)Bsd-CH3142以1:1的比例共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2-TA2-7細(xì)胞。經(jīng)新霉素、潮霉素和殺稻瘟菌素共同加壓篩選穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的HBV復(fù)制細(xì)胞克隆。
　　4.通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)各個(gè)

4、細(xì)胞克隆上清液中的HBV DNA表達(dá)水平；同時(shí)，利用Nano-Glo Luciferase Assay System試劑盒檢測(cè)這些細(xì)胞克隆上清液中熒光素酶量的表達(dá)水平。篩選出HBV DNA表達(dá)水平以及熒光素酶表達(dá)水平均較高的細(xì)胞克隆進(jìn)行進(jìn)一步的相應(yīng)檢測(cè)。
　　5.通過(guò)Native Western Blot檢測(cè)篩選出的細(xì)胞克隆的HBV核心蛋白顆粒的形成。
　　6.通過(guò)Southern blot檢測(cè)篩選出的細(xì)胞克隆中HBV DN

5、A的形成。
　　7.通過(guò)透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒的形成。
　　結(jié)果：
　　1.表達(dá)潮霉素抗性的重組HBV質(zhì)粒pTRE-HBV-S-NLuc與表達(dá)殺稻瘟菌素抗性的HBV輔助質(zhì)粒pcDNA3.1(-)Bsd-CH3142以1:1的比例共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2-TA2-7細(xì)胞，經(jīng)新霉素、潮霉素和殺稻瘟菌素三種抗生素共同加壓篩選，挑選36個(gè)細(xì)胞克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，分別編號(hào)HBV-SNLuc1～36，并應(yīng)用熒光定量 PCR方法

6、和Nano-Glo Luciferase Assay System試劑盒分別檢測(cè)了各個(gè)細(xì)胞克隆上清液中的HBV DNA表達(dá)水平以及熒光素酶的表達(dá)水平。經(jīng)過(guò)分析比較，最終篩選出HBV DNA表達(dá)水平及熒光素酶的表達(dá)量均較高的6個(gè)細(xì)胞克隆進(jìn)一步分析，分別為HBV-SNLuc-(1,12,13,24,35,36)。
　　2.經(jīng)Native Western Blot檢測(cè)，可觀察到6個(gè)細(xì)胞克隆以及HepG2.117細(xì)胞均有核心蛋白顆粒形成，

7、結(jié)果證實(shí)HBV-SNluc細(xì)胞可以產(chǎn)生完整的核心蛋白顆粒。
　　3.經(jīng)Southern blot檢測(cè)，可觀察到6個(gè)細(xì)胞克隆以及HepG2.117細(xì)胞均有疏松環(huán)狀、雙鏈及單鏈HBV DNA的形成，結(jié)果證實(shí)HBV-SNluc細(xì)胞能夠產(chǎn)生HBV的復(fù)制中間體，并有較強(qiáng)的復(fù)制能力。
　　4.經(jīng)過(guò)上述檢測(cè)，確定HBV-SNLuc-35為最佳細(xì)胞株，不僅分泌較高的HBV顆粒，也表達(dá)較高水平的熒光素酶。
　　5.通過(guò)透射電鏡觀察，可以

8、看到HBV-SNLuc-35細(xì)胞克隆能夠產(chǎn)生與對(duì)照組HepG2.117細(xì)胞相似的病毒顆粒。
　　結(jié)論：利用HepG2細(xì)胞成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的并具有HBV復(fù)制的細(xì)胞克隆，經(jīng)系列研究，篩選出一株高效表達(dá)熒光素酶和分泌重組HBV顆粒的細(xì)胞系HBV-SNLuc-35。
　　第二部分：QSG-7701細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)NTCP制備HBV易感細(xì)胞系的研究
　　目的：鑒于QSG-7701細(xì)胞能夠更好的支持HBV的復(fù)制，本研究應(yīng)用Q

9、SG-7701細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽（sodium taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP）的QSG-7701的HBV易感細(xì)胞模型。
　　方法：
　　1.在含有白蛋白啟動(dòng)子的質(zhì)粒pAlb上表達(dá)帶有Flag標(biāo)簽的NTCP基因，再插入一個(gè)潮霉素抗性基因表達(dá)盒，最終構(gòu)建了潮霉素抗性的以白蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)NTCP的質(zhì)粒pAlbHyg-NTCP-Flag。

10、>　　2.表達(dá)NTCP的質(zhì)粒pAlbHyg-NTCP-Flag轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系QSG-7701細(xì)胞。經(jīng)潮霉素加壓篩選穩(wěn)定表達(dá)NTCP的細(xì)胞系QSG-7701NTCP，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)觀察NTCP在細(xì)胞膜表面的表達(dá)，挑選NTCP表達(dá)較強(qiáng)的細(xì)胞克隆。
　　3.復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)曾經(jīng)構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)TC-FIAsH熒光標(biāo)記的HBV復(fù)制型細(xì)胞系TC-3-1，利用上清中濃縮的重組HBV感染QSG-7701NTCP細(xì)胞系以及對(duì)照組293T細(xì)胞、QSG-7

11、701細(xì)胞，經(jīng)過(guò)雙砷熒光染料標(biāo)記以及染核標(biāo)記觀察雙砷熒光的分布情況。
　　4.利用表達(dá)熒光素酶的重組HBV感染穩(wěn)定表達(dá)NTCP的細(xì)胞系，通過(guò)熒光素酶的檢測(cè)，觀察NTCP對(duì)HBV的易感性。
　　結(jié)果：
　　1.pAlbHyg-NTCP-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QSG-7701細(xì)胞，經(jīng)潮霉素加壓篩選，選擇12個(gè)細(xì)胞克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞膜上NTCP的表達(dá)，篩選出表達(dá)量較高的4個(gè)細(xì)胞克隆，分別命名為QSG-7701N

12、TCP1～4其中QSG-7701NTCP2表達(dá)量最高，而未轉(zhuǎn)染NTCP的對(duì)照組QSG-7701只能看到微弱的熒光。
　　2.制備TC-FIAsH熒光標(biāo)記的重組HBV，分別感染QSG-7701NTCP2、293T以及QSG-7701細(xì)胞系，6小時(shí)后通過(guò)雙砷熒光染料標(biāo)記以及染核標(biāo)記可以看到 QSG-7701NTCP能夠在細(xì)胞膜上有較強(qiáng)的熒光表達(dá)， QSG-7701只能觀察到微弱的熒光，而293T細(xì)胞未觀察到熒光，證實(shí)了HBV與肝細(xì)胞膜

13、上NTCP的結(jié)合。
　　3.利用 HBV-SNLuc-35細(xì)胞上清中濃縮的病毒感染 QSG-7701NTCP1～4及 QSG-7701細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)熒光素酶的檢測(cè)，可以觀察到在QSG-7701NTCP1～4細(xì)胞培養(yǎng)上清液中熒光素酶的表達(dá)水平從第4天開始升高，并持續(xù)4-5天，均高于在QSG-7701細(xì)胞系中的表達(dá)，其中QSG-7701NTCP4最高，從而證實(shí)了QSG-7701NTCP細(xì)胞系對(duì)HBV的易感性。
　　結(jié)論：通過(guò)QSG