重組人CR1-SCR1-3活性片段的制備及其對補(bǔ)體介導(dǎo)的膿毒癥炎癥損傷的保護(hù)性研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS),是嚴(yán)重創(chuàng)(燒)傷、感染性疾病以及大手術(shù)后患者常見并發(fā)癥,如不及時(shí)治療和控制,可導(dǎo)致休克及多器官功能障礙綜合癥(Multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS),是當(dāng)前醫(yī)院住院患者最主要的死亡原因之一。目前尚無有效的防治藥物用于臨床治療。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及到補(bǔ)體

2、、凝血、纖溶等多個(gè)系統(tǒng)及它們之間復(fù)雜的相互作用,對膿毒癥的病理生理學(xué)和流行病學(xué)還缺乏全面的認(rèn)識。近年來國內(nèi)外學(xué)者針對膿毒癥的發(fā)病機(jī)制開展了許多研究,其中越來越多的研究表明補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活是膿毒癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,抑制補(bǔ)體的過度活化已成為防治膿毒癥炎癥損傷的重要策略。
　　在經(jīng)典、旁路、甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)三條補(bǔ)體激活途徑中,雖然活化起始點(diǎn)不同,但都在C3處匯合,形成C3轉(zhuǎn)化酶,由此啟動下游一系列介導(dǎo)炎癥損傷的介質(zhì)生

3、成。CR1-SCR1-3段能結(jié)合C4b,抑制C3/C5轉(zhuǎn)化酶,可抑制過量C5a、C5b-9等片段的生成,在始動部位防止膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在重組人CR1-SCR1-3活性片段的制備及其對補(bǔ)體介導(dǎo)的膿毒癥炎癥損傷的保護(hù)性研究,為補(bǔ)體介導(dǎo)的膿毒癥的防治提供新的思路和途徑。
　　本課題在我室已構(gòu)建的重組工程菌pPIC9k-CR1-SCR1-3/KM71的基礎(chǔ)上,復(fù)蘇工程菌,挑取優(yōu)勢菌落以無水甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)目的蛋白,SDS-PA

4、GE電泳分析,Western-Blot目的蛋白鑒定,Ni-NTA樹脂親和層析純化目的蛋白,CH50酶聯(lián)免疫分析(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測體外補(bǔ)體抑制活性,觀察目的蛋白對補(bǔ)體介導(dǎo)的膿毒癥小鼠炎癥損傷的保護(hù)作用。該研究主要獲得以下結(jié)果:
　　1、復(fù)蘇工程菌pPIC9k-CR1-SCR1-3/KM71后,以無水甲醇誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,可見表達(dá)蛋白的大小約為

5、27kD,Western-Blot鑒定,在分子量約27kD處出現(xiàn)單一條帶,呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。證實(shí)表達(dá)出的蛋白是所構(gòu)建His標(biāo)簽的重組蛋白,且復(fù)蘇后的工程菌仍可以穩(wěn)定的表達(dá)重組蛋白CR1-SCR1-3。
　　2、表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析純化后,SDS-PAGE顯示目的蛋白純度較高,用BCA試劑盒測定蛋白濃度并計(jì)算純化前后目的蛋白產(chǎn)率,CR1-SCR1-3約為30％。
　　3、體外CH50ELISA法檢測補(bǔ)體抑制活性,結(jié)果顯示:重組人

6、CR1-SCR1-3蛋白具有較高的補(bǔ)體抑制活性,其補(bǔ)體抑制率隨蛋白濃度的增高而增高,當(dāng)重組人CR1-SCR1-3蛋白濃度達(dá)到50μg/ml時(shí),具有抑制50%補(bǔ)體的生物活性,表明重組人CR1-SCR1-3蛋白具有良好的抑制補(bǔ)體活性的功能。
　　4、采用D-氨基半乳糖增敏內(nèi)毒素攻擊小鼠成功構(gòu)建了膿毒癥(sepsis)模型。觀察重組人CR1-SCR1-3蛋白對補(bǔ)體介導(dǎo)的膿毒癥小鼠炎癥損傷的保護(hù)作用,我們發(fā)現(xiàn):膿毒癥組的膿毒癥反應(yīng)最強(qiáng)烈,

7、16h后全部死亡,保護(hù)組的膿毒癥癥狀減輕,16h后生存率達(dá)40%,顯著提高(P<0.05)。膿毒癥組的血清促炎癥介質(zhì)IL-1β和肺組織MPO水平均明顯升高,保護(hù)組的顯著降低(P<0.001)。膿毒癥組的肺組織原位補(bǔ)體C4b沉積明顯增多,保護(hù)組的明顯減少。病理學(xué)檢查顯示,膿毒癥組的可見肺間質(zhì)內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞聚集和浸潤,肺泡壁內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血,肺泡和間質(zhì)有不同程度的肺水腫;部分肺泡壁變薄斷裂,泡腔膨大,呈現(xiàn)不同程度的肺氣腫;部分肺間質(zhì)細(xì)

8、支氣管周圍肺泡隔纖維增生,以致萎陷。CR1-SCR1-3保護(hù)組的上述病變明顯減輕。結(jié)果表明重組人CR1-SCR1-3蛋白可以抑制補(bǔ)體過度活化,減輕補(bǔ)體介導(dǎo)的膿毒癥炎癥損傷。
　　綜上所述,通過甲醇誘導(dǎo)工程菌pPIC9k-CR1-SCR1-3/KM71大劑量的表達(dá)目的蛋白,經(jīng)鎳柱親和層析一步純化獲得純度較高的目的蛋白;并證實(shí)重組人CR1-SCR1-3蛋白在體外具有抑制補(bǔ)體活性;在小鼠體內(nèi)對補(bǔ)體介導(dǎo)的膿毒癥炎癥損傷有較好的保護(hù)效應(yīng)。本