轉(zhuǎn)膠蛋白Transgelin誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞系LNCαP凋亡和衰老的初步研究.pdf

1、本文對(duì)轉(zhuǎn)膠蛋白Transgelin誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞系LNCαP凋亡和衰老進(jìn)行了研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：觀察轉(zhuǎn)膠蛋白對(duì)肌動(dòng)蛋白更新的影響。
　　 目的：研究轉(zhuǎn)膠蛋白對(duì)肌動(dòng)蛋白更新、細(xì)胞ROS水平的影響，并進(jìn)一步觀察其對(duì)DNA損傷傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞衰老的影響。
　　 方法：將轉(zhuǎn)膠蛋白轉(zhuǎn)染至人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP，檢測(cè)細(xì)胞絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)和球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)的變化，并檢測(cè)

2、細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。通過(guò)8-OH-dG、phospho-ATM和γH2AX免疫熒光染色觀察DNA損傷情況，進(jìn)一步通過(guò)Westernblotting檢測(cè)DNA損傷傳導(dǎo)途徑ATM(Ataxia-Telangiectasia Mutated)-Chk2(checkpoint kinase2)-p53的變化。通過(guò)Heterochromatin proteinl(HP1)免疫熒光染色、western blotting和半乳糖苷酶細(xì)胞(β-ga

3、l)化學(xué)染色等方法，觀察外源性轉(zhuǎn)膠蛋白和內(nèi)源性轉(zhuǎn)膠蛋白分別對(duì)LNCaP和MRC5細(xì)胞染色質(zhì)重構(gòu)及細(xì)胞衰老的影響。同時(shí)，通過(guò)SiRNA抑制人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS內(nèi)源性轉(zhuǎn)膠蛋白的表達(dá)，觀察細(xì)胞F-actin、G-actin的變化和ROS的變化。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白至LNCaP細(xì)胞后24h，細(xì)胞F-actin增加明顯，G-actin無(wú)明顯變化，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高；轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞Si-transgelin RNA48h后，轉(zhuǎn)膠

4、蛋白水平明顯下降，細(xì)胞F-actin下降，ROS水平下降。LNCaP轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后，免疫熒光染色提示細(xì)胞核出現(xiàn)8-OH-dG陽(yáng)性染色，phospho-ATM熒光強(qiáng)度增加及γH2AX簇集的增多。Western blotting提示ATM-Chk2-p53途徑的激活。HP1免疫熒光染色提示LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后，細(xì)胞衰老相關(guān)的異染色質(zhì)簇集(Senescence-associated heterochromatin Foci，SAHF)

5、增多，western blotting提示HP1γ表達(dá)水平上升較明顯，acetyl-H3表達(dá)下降。β-半乳糖苷酶細(xì)胞化學(xué)染色提示轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白36 h后，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多。HP1免疫熒光染色和western blotting提示MRC5高代細(xì)胞轉(zhuǎn)膠蛋白表達(dá)量較低代細(xì)胞多，同時(shí)SAHF也較低代細(xì)胞多。低代MRC5細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后，β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞增加。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)膠蛋白通過(guò)促進(jìn)LNCaP細(xì)胞F-actin聚集，可使細(xì)胞發(fā)生

6、DNA氧化損傷和DNA斷裂，激活DNA損傷信號(hào)傳導(dǎo)通路。轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白使LNCaP細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞衰老。內(nèi)源性轉(zhuǎn)膠蛋白和MRC5細(xì)胞衰老有關(guān)，若使MRC5過(guò)度表達(dá)轉(zhuǎn)膠蛋白，可導(dǎo)致細(xì)胞衰老。
　　 第二部分：觀察轉(zhuǎn)膠蛋白和p53之間的相互作用。
　　 目的：研究轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白至LNCaP細(xì)胞后，p53的表達(dá)及其分布的變化，并且研究轉(zhuǎn)膠蛋白和p53之間的相互作用。
　　 方法：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白至LNCaP細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)提取全

7、細(xì)胞裂解產(chǎn)物和胞漿、胞核細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行western blotting檢測(cè)p53表達(dá)情況，并使用轉(zhuǎn)膠蛋白和p53免疫熒光染色檢測(cè)p53分布情況。隨后，我們采用哺乳類細(xì)胞雙雜交和免疫共沉淀方法研究轉(zhuǎn)膠蛋白和p53蛋白之間的相互作用。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后，Western blotting提示LNCaP細(xì)胞p53表達(dá)增加，磷酸化p53(Ser46)也相應(yīng)增加；胞漿中p53增加，而胞核中p53變化不明顯。轉(zhuǎn)膠蛋白和p53雙免疫

8、熒光染色也提示胞漿中p53水平增加。哺乳類細(xì)胞(人前列腺癌PC-3細(xì)胞)雙雜交實(shí)驗(yàn)提示轉(zhuǎn)膠蛋白和p53相互結(jié)合，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示外源性、內(nèi)源性轉(zhuǎn)膠蛋白和p53分別在LNCaP細(xì)胞和BJ細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)共沉淀。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白使LNCaP細(xì)胞p53表達(dá)增高，而且p53胞漿轉(zhuǎn)位增加。轉(zhuǎn)膠蛋白和p53在哺乳類細(xì)胞內(nèi)相互作用，并穩(wěn)定p53蛋白。轉(zhuǎn)膠蛋白和p53免疫共沉淀。
　　 第三部分：轉(zhuǎn)膠蛋白對(duì)p53下游基因及

9、內(nèi)源性凋亡途徑的影響。
　　 目的：研究轉(zhuǎn)膠蛋白對(duì)p53下游基因表達(dá)的影響，以及轉(zhuǎn)膠蛋白誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡的機(jī)理。
　　 方法：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白至LNCaP細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物，使用westernblotting檢測(cè)PUMA(p53 upregulated modulator of apoptosis)、Bax、Bcl-2和caspase-3的表達(dá)情況，然后分別將轉(zhuǎn)膠蛋白轉(zhuǎn)染HCT116 p53-/-和p5

10、3+-+細(xì)胞株，westernblotting檢測(cè)p53下游PUMA的表達(dá)情況。最后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶dUTP標(biāo)記方法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)等方法觀察轉(zhuǎn)膠蛋白對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后，LNCaP細(xì)胞促凋亡因子Bax和PUMA表達(dá)量升高，而抗凋亡因子Bcl

11、-2表達(dá)水平下降，caspase-3的表達(dá)上升。分別轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白至HCT116p53-/-和p53+/+細(xì)胞株，p53陰性細(xì)胞株P(guān)UMA無(wú)明顯變化；而p53陽(yáng)性細(xì)胞株P(guān)UMA表達(dá)升高。細(xì)胞計(jì)數(shù)提示轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后細(xì)胞活力下降，TUNEL染色提示轉(zhuǎn)膠蛋白導(dǎo)致TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量升高，而流式細(xì)胞計(jì)數(shù)亦提示轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后早期細(xì)胞凋亡增多。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)膠蛋白通過(guò)上調(diào)促凋亡因子(PUMA、Bax)及抑制抗凋亡因子Bcl-2誘導(dǎo)內(nèi)源性凋