慢病毒介導的PDE4DmiRNA對抑郁癥和認知損傷的調(diào)節(jié)作用及其機制研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學2011級博士學位論文慢病毒介導的PDE4DmiRNA對抑郁癥和認知損傷的調(diào)節(jié)作用及其機制研究RoleofLentivirus—mediatedPDE4DmiRNAonDepressionandCognitiveImpairement課題來源：國家自然科學基金一廣東省聯(lián)合基金專業(yè)名稱學位申請人指導教師答辯委員會藥理學張聰徐江平張漢霆主席余細勇教授答辯委員會成員論文評閱人劉培慶教授黎明濤教授臧林泉教授李國鋒教授年月日廣州中文摘

2、要AB42誘導的學習記憶損傷模型中小鼠認知行為的調(diào)節(jié)作用及其對cAMP信號通路和促炎因子的影響。該研究為進‘步闡明長鏈PDE4D在抑郁癥和認知障礙疾病中的作用提供實驗依據(jù)。研究方法：(1)首先構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生PDE4D4miRNA的重組質(zhì)粒，與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞產(chǎn)生高滴度慢病毒。體外感染培養(yǎng)的293T細胞檢測其轉(zhuǎn)染效率。采用腦立體定位技術(shù)在小鼠海馬DG區(qū)微量注射慢病毒介導的PDE4DmiRNA引起目的基因表達沉默，14天后取

3、海馬組織檢測PDE4DmiRNA對PDE4A／B／D以及PDE4D3／4／5的mRNA水平的影響。(2)采用慢性不可預知性溫和刺激使小鼠接受應(yīng)激67天，誘導產(chǎn)生小鼠抑郁樣癥狀，糖水偏愛實驗檢測小鼠抑郁程度。抑郁模型建立后，采用腦立體定位技術(shù)在小鼠海馬DG區(qū)微量注射慢病毒，14天后進行行為學實驗。強迫游泳實驗，懸尾實驗和糖水偏愛實驗反應(yīng)小鼠抑郁狀態(tài)；高架十字迷宮實驗和曠場實驗反應(yīng)小鼠的焦慮狀態(tài)；高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測小鼠海馬中cAMP水

4、平；PcR技術(shù)和westcmBlot技術(shù)分別檢測了小鼠海馬cAMPPKA—cREB通路的變化。(3)采用Morris水迷宮實驗，新物體識別實驗和跳臺實驗評價小鼠的學習記憶能力。小鼠雙側(cè)海馬DG區(qū)注射老化的Ap42(05肛g／side)誘導小鼠學習記憶損傷，24小時后注射慢病毒在同一位點，14天后采用水迷宮和新物體識別用來評價小鼠的學習記憶能力；高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測小鼠海馬中cAMP水平；PcR技術(shù)和WestemBlot技術(shù)分別檢測了

5、小鼠海馬cAMPPKA—cREB通路以及炎癥因子的變化。研究結(jié)果：(1)慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞72小時后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。無論攜帶陰性對照還是PDE4D基因序列的慢病毒均表現(xiàn)出強烈的熒光。在動物體內(nèi)實驗中亦發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果。而且，PDE4DmiRNA能顯著降低PDE4D，PDE4D4和PDE4D5的表達水平，而對PDE4A／B和PDE4D3的表達沒有顯著性影響。(2)在小鼠經(jīng)歷慢性不可預知性溫和刺激過程中，應(yīng)激小鼠