高三尖杉酯堿誘導(dǎo)的白血病耐藥細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化.pdf

1、白血病（Leukemia）是臨床常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，化療仍是其治療的主要手段。高三尖杉酯堿（Homoharringtonine，HHT）系從粗榧屬植物中提取的一種生物堿，是高效抗白血病藥物，主要用于急性髓細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病和骨髓增生異常綜合征的治療。近期研究表明，HHT還可用于干擾素治療失敗和伊馬替尼耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病的治療。然而，臨床治療中發(fā)現(xiàn)，長時(shí)間應(yīng)用HHT治療后患者會出現(xiàn)多藥耐藥（multidrug resis

2、tance，MDR）現(xiàn)象，它與蒽環(huán)類、鬼臼類及長春新堿類等還有交叉耐藥性。白血病細(xì)胞產(chǎn)生MDR是導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)及化療失敗的主要原因，現(xiàn)今研究初步證實(shí)其多藥耐藥機(jī)制涉及P-gp等跨膜糖蛋白、GSH/GST等酶系統(tǒng)、DNA修復(fù)以及多種凋亡相關(guān)基因等，但仍不能圓滿解釋白血病細(xì)胞產(chǎn)生MDR的機(jī)制，而且在臨床上根據(jù)現(xiàn)有的多藥耐藥機(jī)制采取的逆轉(zhuǎn)耐藥措施并不十分有效。因此，尋找新的與HHT耐藥相關(guān)基因，揭示耐藥機(jī)制，進(jìn)而發(fā)展新的逆轉(zhuǎn)耐藥方法十分必要。

3、主要研究內(nèi)容和主要結(jié)果如下： 第一部分：基因芯片篩選K562/HHT細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)基因 基因芯片技術(shù)是一種快速高通量地分析細(xì)胞或生物體中核酸序列信息的研究方法。將該技術(shù)運(yùn)用于腫瘤耐藥研究有助于篩選新的耐藥相關(guān)基因，對于腫瘤耐藥機(jī)制研究及耐藥個(gè)體化診斷具有重要促進(jìn)作用。為此，本部分研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)來研究HHT誘導(dǎo)的白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/HHT基因表達(dá)譜的變化，初步篩選出與K562/HHT細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)的基因

4、。 目的：用基因芯片技術(shù)篩選出與K562/HHT細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)的基因。 方法：在前期建立的K562/HHT多藥耐藥細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，采用基因芯片技術(shù)兩兩比較K562/HHT細(xì)胞與其親本細(xì)胞K562，K562/HHT細(xì)胞與用耐藥逆轉(zhuǎn)劑米非司酮（RU486）作用后的細(xì)胞K562/HHT/RU486間的基因表達(dá)譜差異。 結(jié)果： K562/HHT與K562細(xì)胞相比，共有117個(gè)基因表達(dá)有顯著差異，其中57個(gè)基因表達(dá)明顯上

5、調(diào)，60個(gè)基因表達(dá)明顯下調(diào)，K562/HHT中多藥耐藥基因mdr-1表達(dá)明顯上調(diào)（Ratio=4．2899）； K562/HHT/RU486細(xì)胞與K562/HHT細(xì)胞相比，有13個(gè)基因表達(dá)明顯上調(diào)，37個(gè)基因表達(dá)明顯下調(diào)。這些差異表達(dá)的基因涉及耐藥、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等。基因NM-001721（BMX）、NM-031459（SESN2）、NM-033642（FGF13）和AL-049309（SFR

6、S12）在兩組芯片中的表達(dá)均有顯著差異。其中BMX基因（bone marrow tyrosine kinase gene in chromosome X）在K562/HHT細(xì)胞中表達(dá)較K562細(xì)胞上調(diào)（Ratio=2．6036），在K562/HHT/RU486細(xì)胞則較K562/HHT細(xì)胞減低（Ratio=0．4603）。 結(jié)論：運(yùn)用基因芯片技術(shù)獲得了與HHT誘導(dǎo)的多藥耐藥細(xì)胞K562/HHT耐藥相關(guān)候選基因的信息。 第二

7、部分：BMX參與HHT誘導(dǎo)的白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/HHT耐藥及機(jī)制的初步研究 BMX是從人骨髓細(xì)胞中克隆、分離到的一種基因，定位于染色體Xp22．2，其mRNA長度2．7kb，編碼一種80kD的蛋白，屬于細(xì)胞內(nèi)非受體型酪氨酸蛋白激酶Tec/Btk家族。BMX廣泛表達(dá)在動(dòng)脈內(nèi)皮、胎兒心內(nèi)膜、粒細(xì)胞、骨髓細(xì)胞株以及前列腺細(xì)胞株等，參與胞內(nèi)外多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其功能非常廣泛，與細(xì)胞粘附、遷移、增殖和存活等相關(guān)。然而目前還沒有關(guān)于

8、BMX與白血病細(xì)胞耐藥性的相關(guān)研究。在前部分研究中我們用基因芯片技術(shù)篩選與K562/HHT細(xì)胞耐藥相關(guān)的候選基因，發(fā)現(xiàn)BMX可能與HHT誘導(dǎo)的白血病多藥耐藥細(xì)胞K562/HHT的耐藥性形成相關(guān)，該部分進(jìn)一步驗(yàn)證BMX基因在HHT誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞耐藥形成中的作用，并探討其作用機(jī)制。 目的：探討B(tài)MX基因在HHT誘導(dǎo)的人白血病耐藥細(xì)胞K562/HHT耐藥性形成中的作用及其機(jī)制。 方法：運(yùn)用RT-PCR和Western blo

9、t法驗(yàn)證分別從mRNA和蛋白水平驗(yàn)證BMX在K562和K562/HHT細(xì)胞中表達(dá)的基因芯片結(jié)果后，將BMX質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到K562和K562/HHT細(xì)胞，然后運(yùn)用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)觀察這兩種細(xì)胞對幾種常用化療藥物的耐藥性的變化和細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素（DNR）含量的變化。 結(jié)果： RT-PCR和Western blot法均證實(shí)BMX在K562/HHT細(xì)胞中表達(dá)較K562細(xì)胞上調(diào)，K562/HHT/RU486細(xì)胞中BMX表達(dá)較K562/H

10、HT減低。BMX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功后，MTT法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染BMX質(zhì)粒的K562細(xì)胞獲得耐藥性，而轉(zhuǎn)染BMX質(zhì)粒的K562/HHT細(xì)胞耐藥性增加。流式細(xì)胞術(shù)檢測到轉(zhuǎn)染BMX質(zhì)粒后的K562及K562/HHT細(xì)胞內(nèi)DNR含量分別為（79．28±4．04）和（29．84±2．67），均較轉(zhuǎn)染前（158．52±8．08）和（58．58±6．53）顯著減低。 結(jié)論：發(fā)現(xiàn)BMX與高三尖杉酯堿誘導(dǎo)的多藥耐藥細(xì)胞K562/HHT多藥耐藥性的形成相關(guān)，BM