硼替佐米聯(lián)合三尖杉酯堿或三氧化二砷對急性髓系白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響.pdf

1、背景與目的： 急性白血病是一類起源于造血干細(xì)胞病變的惡性克隆性疾病，雖然近年來以大劑量化療為主的綜合療法的廣泛應(yīng)用，使其治療效果有了明顯提高，但仍然有相當(dāng)一部分患者因疾病復(fù)發(fā)或耐藥而轉(zhuǎn)變成難治，因此積極尋求新的治療方法，在當(dāng)前仍然顯得尤為必要。 目前受格列衛(wèi)治療慢性粒細(xì)胞白血病(CML)巨大成功的影響，分子靶向藥物的研究正成為腫瘤治療的領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，而這其中又以蛋白酶體抑制劑的研究更為引人注目瞳。近年研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體是

2、一類廣泛存在于所有真核細(xì)胞內(nèi)具有多種催化功能的酶復(fù)合體，其在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解、MHC-Ⅰ類抗原呈遞、細(xì)胞內(nèi)部錯(cuò)誤折疊蛋白的修復(fù)上發(fā)揮著重要功能。多種與細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的正常代謝，都與其功能的正確執(zhí)行密切相關(guān)。特異性阻斷蛋白酶體功能將顯著改變此類蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。目前作為第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)的蛋白酶體抑制劑類藥物——硼替佐米(bortezomib，Bor)已經(jīng)

3、進(jìn)入臨床，并且在難治、復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤(MM)的治療中顯示出良好療效<'[4]>。此外，在其他惡性血液系統(tǒng)疾病以及實(shí)體瘤方面，亦有初步結(jié)果報(bào)道：bortezomib單獨(dú)或聯(lián)合其它藥物對非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、成人T細(xì)胞白血病、肺癌、卵巢癌等具有良好療效<'[5,6,7,8]>。目前，除MM外國際上對硼替佐米的研究較多局限于淋巴瘤、CLL，對于國內(nèi)高發(fā)的急性髓系白血病方面的研究至今報(bào)道很少，為此我們探討

4、boxtezomib對急性髓系白血病細(xì)胞增殖和凋亡影響，特別是與國內(nèi)常用白血病化療藥物三尖杉酯堿(harringtOnine，HT)、三氧化二砷(Arsenic trioxide，As<,2>O<,3>)聯(lián)合應(yīng)用的效果，旨在為今后白血病治療探索新的方法。 方法： 選取HL60白血病細(xì)胞為研究對象，細(xì)胞培養(yǎng)體系為含10％小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基。為確定bortezomib對HL60白血病細(xì)胞的最佳處理濃度和時(shí)間，先

5、用0～1000nM劑量體外處理HL60白血病細(xì)胞0～48h，依據(jù)臺(tái)盼蘭拒染計(jì)數(shù)法檢測各濃度處理后細(xì)胞增殖狀況，確定0～50nM劑量為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。bortezomib單獨(dú)應(yīng)用后細(xì)胞增殖活力變化采用MTT比色法檢測，細(xì)胞凋亡采用DNA凝膠電泳、Hoechst33342熒光染色、流式細(xì)胞儀法檢測。確定bortezomib作用24h為最佳處理時(shí)間。選擇7.5～75nM HT和5～50μM As<,2>O<,3> 處理HL60白血病細(xì)胞24h，

6、分別確定其對細(xì)胞的IC<,50>值。選擇此劑量HT或As<,2>O<,3>，與bortezomib聯(lián)合處理HL60白血病細(xì)胞和8例AML 患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(白血病細(xì)胞比例(56～95％)，并用相同的方法檢測各聯(lián)合組細(xì)胞增殖、凋亡變化，統(tǒng)計(jì)分析各組問細(xì)胞增殖、凋亡之差異。 結(jié)果： 1． bort@zomib對HL60白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響臺(tái)盼蘭拒染計(jì)數(shù)法顯示：0、10、20、30、40nM bortezomib處理H

7、L60白血病細(xì)胞6h，各濃度間活細(xì)胞數(shù)差異無顯著性意義(P=0.461)，延長作用時(shí)間到12小時(shí)，各濃度對HL60白血病細(xì)胞生長抑制效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，隨時(shí)間延長和濃度增加，各處理組活細(xì)胞數(shù)逐漸減少，其中30nM劑量處理24h，可基本抑制HL60細(xì)胞增殖。MTT比色法顯示：10～50nM bortezomib處理HL60細(xì)胞12～ 48h，各劑量組細(xì)胞增殖活性均出現(xiàn)下降。其中12h時(shí)，各組細(xì)胞活性分別降至對照組的82％、75％、60％

8、、50％和44％。24h時(shí)，各劑量組細(xì)胞活性下降為對照的77％、46％、31％、24％和23％。與12h結(jié)果比較，差異均有顯著性意義(P均<0.05)。但與48h比，各組細(xì)胞活性未見明顯下降，(P均>0.05)。瓊脂糖凝膠電泳顯示：10～50nM bortezomib處理HL60細(xì)胞12h，電泳均可見DNA Ladder出現(xiàn)，其中l(wèi)OnM劑量組細(xì)胞凋亡不完全，可見正?；蚪M條帶與DNA Ladder共存；處理24h時(shí)各劑量組仍可見DNA

9、 Ladzler出現(xiàn)，但lOnM組正?；蚪M條帶消失。Hoechst33342熒光染色顯示：10～50nM bortezomib均可誘導(dǎo)HL60白血病細(xì)胞凋亡，且每視野下高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于低劑量組。流式細(xì)胞儀檢測顯示：培養(yǎng)12h對照組亞G<,1>期細(xì)胞比例為1.9％，而10nM、30nMbortezomib處理組則分別為5.9％和59％，與對照組相比差異具有顯著性意義(P均<0.05)。延長處理時(shí)間至24h，對照組亞G<,1>

10、期細(xì)胞比例無明顯變化，而10nM、30nM bortezomib處理組亞G<,1>期細(xì)胞比例分別增加至19％和62％。與12h結(jié)果相比較，10nM組兩處理時(shí)間之間結(jié)果具有顯著性差異(P均<0.05)，但30nM組處理效果不受時(shí)間影響(59％：62％)。2． bortezomib聯(lián)合三尖杉酯堿或三氧化二砷對HL60白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響．MTI、比色法顯示：HT與As<,2>O<,3>單獨(dú)應(yīng)用對HL60白血病細(xì)胞同樣具有濃度依賴性的抑

11、制增殖作用。其對HL60白血病細(xì)胞24h的IC<,50>劑量分別為30nM和15μM。選擇此劑量HT、As<,2>O<,3>分別與10～50nM bortezomib聯(lián)合處理HL60白血病細(xì)胞，在達(dá)到藥物最大抑制效果前，10nM bortezomib聯(lián)合HT或As<,2>O<,3>處理組細(xì)胞活性顯著降至40％和33％，與同劑量單藥組相比，差異均具有顯著性意義(P均<0.05)。Hoechst33342熒光染色顯示：HT、As<,2>O<

12、,3>單獨(dú)應(yīng)用均可誘導(dǎo)HL60白血病細(xì)胞凋亡，分別與bortezomib聯(lián)合后，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著多于藥物各自單獨(dú)處理時(shí)效果。流式細(xì)胞儀分析顯示：30nM HT和15μM As<,2>O<,3>處理HL60白血病細(xì)胞24h，其凋亡亞G<,1>期細(xì)胞比例分別為11％和19％，與對照組2％相比差異均具有顯著性意義(P均<0.05)。相同條件下，同劑量HT、As<,2>O<,3>與10nM bortezomib聯(lián)合后，凋亡亞G<,1>期細(xì)胞比例

13、分別增至44％和47％，與各單藥組效果相比差異同樣具有顯著性意義(P均<0.05)。3．bortezomib聯(lián)合三尖杉酯堿或三氧化二砷對急性髓系原代白血病細(xì)胞增殖的影響8例治療前AML 患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞處理后顯示：10～500nM bortezomib體外對急性髓系原代白血病細(xì)胞同樣具有濃度依賴性的抑制增殖作用，隨bortezomib劑量增加，各患者原代白血病細(xì)胞活力逐漸下降，但除500nM外，lO～100nM劑量組之間細(xì)胞活力差異無

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。HT與As<,2>O<,3>單藥對急性髓系原代白血病細(xì)胞同樣具有濃度依賴性的抑制增殖作用，但與HL60白血病細(xì)胞株相比，同劑量HT(30nM)處理后，原代細(xì)胞增殖活力顯著高于HL60白血病細(xì)胞株結(jié)果，而As<,2>O<,3>(15μM)處理后兩者間無明顯差異。20nM bortezomib聯(lián)合30nM HT或15PM As<,2>O<,3>處理急性髓系原代白血病細(xì)胞后，其細(xì)胞活力均比單藥時(shí)降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

15、異，(P>0.05)。但是，bortezomib聯(lián)合As<,2>O<,3>組與As<,2>O<,3>單藥組細(xì)胞活性差異接近臨界值(0.51:0.61，P=0.07)。 結(jié)論： 1．bortezomib單藥對急性髓系HL60白血病細(xì)胞具有時(shí)間一濃度依賴性的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，隨時(shí)間延長和劑量增加作用顯著增強(qiáng)。 2．HT與As<,2>O<,3>單藥對急性髓系HL60白血病細(xì)胞均具有劑量依賴性的抑制增殖作用，選其各

16、自的IC<,50>劑量分別與bortezomib聯(lián)合處理后，對HL60白血病細(xì)胞的作用比各自單獨(dú)應(yīng)用時(shí)明顯增強(qiáng)。 3．bortezomib、HT、As<,2>O<,3>單藥對急性髓系原代白血病細(xì)胞同樣具有劑量依賴性的抑制增殖作用，但與HL60白血病細(xì)胞株結(jié)果相比，bortezomib、HT對原代白血病細(xì)胞敏感性弱，而As<,2>O<,3>敏感性無顯著變化。 4．bortezomib與HT或As<,2>O<,3>聯(lián)合作用原