硼替佐米聯(lián)合三尖杉酯堿或三氧化二砷對(duì)耐藥急性髓系白血病細(xì)胞增殖、凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的： 盡管急性白血病的治療效果近年來(lái)有了較明顯的提高，但仍然有15～30％的病人發(fā)生原發(fā)性耐藥，60～80％的患者完全緩解后因繼發(fā)性耐藥復(fù)發(fā)而死亡[1]。隨著生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解大部分是通過(guò)泛素一蛋白酶體通路(Ubiquitin-ProteasePathway，UPP)完成，人白血病細(xì)胞含有異常高水平的蛋白酶體活性，且在誘導(dǎo)終末白血病細(xì)胞分化時(shí)蛋白酶體迅速被下調(diào)，表明蛋白酶體的活性與白血病細(xì)胞

2、的惡性增殖有著密切相關(guān)性，因此蛋白酶體可能成為白血病治療的新靶點(diǎn)[2]。 目前研究證實(shí)，蛋白酶體在細(xì)胞內(nèi)蛋白降解、MHC-I類抗原遞呈、細(xì)胞內(nèi)部錯(cuò)誤折疊蛋白的修復(fù)上發(fā)揮著重要的功能，多種與細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白的正常代謝，都與其功能的正確執(zhí)行密切相關(guān)。特異性阻斷蛋白酶體功能顯著改變以上蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，是目前認(rèn)識(shí)的蛋白酶體抑制劑主要的抗腫瘤作用機(jī)制[3

3、]。 硼替佐米(Bortezomib)是第一個(gè)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床的蛋白酶體抑制劑，唯一的適應(yīng)癥是難治、復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤(MultipleMyeloma，MM)的治療[4]。此外，初步的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明硼替佐米單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物治療非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、成人T細(xì)胞白血病、肺癌、卵巢癌等也具有良好效果[5]。有關(guān)硼替佐米治療急性髓系白血病的研究至今很少報(bào)道，我們前期工作中發(fā)現(xiàn)硼替佐米體外能夠抑制急性髓系白血

4、病細(xì)胞株HL60的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，與三尖杉酯堿(HT)或三氧化二砷(AS2O3)聯(lián)合后作用明顯增強(qiáng)[6-9]，但它們對(duì)產(chǎn)生多藥耐藥的急性髓系白血病細(xì)胞的作用如何至今尚缺乏報(bào)道，此乃是本研究立題的主要?jiǎng)訖C(jī)。 研究方法： 首先選擇急性髓系白血病多藥耐藥細(xì)胞株HL60／ADM為研究對(duì)象。應(yīng)用MTT法比較HL60／ADM和HL60細(xì)胞之間對(duì)阿霉素殺傷作用的敏感性。以耐藥倍數(shù)大于30倍定義為耐藥，此后將HL60／ADM細(xì)胞培養(yǎng)于

5、含有10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)在0～1000nM之間篩選硼替佐米對(duì)HL60／ADM細(xì)胞作用的最佳濃度，在0～72h之間選擇處理的最佳時(shí)間，在0～752nM之間確定HT的IC50濃度，在0～4μM之間確定AS2O3的IC50濃度，依據(jù)臺(tái)盼藍(lán)拒染法確定各實(shí)驗(yàn)組處理后細(xì)胞存活情況。 確定硼替佐米0～50nM為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度，作用48h為最佳處理時(shí)間。硼替佐米的IC50濃度約為20nM，HT的IC50濃

6、度為752nM，AS2O3的IC50濃度為15μM。在上述預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將HL60／ADM細(xì)胞分為硼替佐米、As2O3或HT單藥處理組、硼替佐米聯(lián)合AS2O3處理組和硼替佐米聯(lián)合HT處理組，每組處理的細(xì)胞數(shù)一致，每組均設(shè)置空白對(duì)照組。各組檢測(cè)指標(biāo)相同，即用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖、應(yīng)用AnnexinV-FITC／PI染色流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HL60／ADM細(xì)胞攝取阿霉素的情況。

7、 在完成上述實(shí)驗(yàn)研究之后，選擇9例復(fù)發(fā)、難治性急性髓系白血病患者原代細(xì)胞應(yīng)用MTT法研究其增殖變化。硼替佐米不同濃度間增殖活性差異采用單因素方差分析；硼替佐米聯(lián)合HT或AS2O3對(duì)HL60／ADM白血病細(xì)胞增殖活性影響比較使用析因分析；細(xì)胞凋亡改變采用方差分析，兩兩比較采用LSD法；阿霉素陽(yáng)性率比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。藥物聯(lián)合后對(duì)原代細(xì)胞的細(xì)胞活性差異采用隨機(jī)區(qū)組方差分析，兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)。 結(jié)論： 1、硼替佐米單

8、藥對(duì)HL60／ADM多藥耐藥細(xì)胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，其效果呈時(shí)間-劑量依賴性，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加作用顯著增強(qiáng)。 2、三尖杉酯堿和三氧化二砷對(duì)HL60／ADM多藥耐藥細(xì)胞均具有抑制增殖作用，效果呈劑量依賴性，各自的IC50劑量下分別與不同濃度硼替佐米聯(lián)合處理后，與硼替佐米單藥處理組相比，其抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用明顯增強(qiáng)。 3、硼替佐米能夠促進(jìn)HL60／ADM細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取，提高細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度，從而降