高三尖杉酯堿作用白血病細胞靶蛋白篩選及作用機制研究.pdf

1、背景:
　　白血病是起源于造血系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，嚴重危害著人類健康。但是，其發(fā)病原因和疾病發(fā)展的確切病理機制迄今仍未闡明。目前，化學藥物聯(lián)合化療依然是臨床上大多數(shù)白血病患者最常用的治療方法。
　　高三尖杉酯堿是由中國科研人員于20世紀70年代首先從中草藥南方粗榧堿中提取出來的抗白血病生物堿，在臨床上已經(jīng)被廣泛應用于急性髓系白血病的治療，并取得了良好的療效。此外，多項臨床試驗表明，高三尖杉酯堿在伊馬替尼治療失敗的慢性髓系白血

2、病患者中仍然具有治療價值，尤其是在T315I突變的慢粒治療中起重要作用，提示該藥物可作為慢性髓系白血病患者的挽救治療選擇。目前藥物作用的分子機制尚不清楚，現(xiàn)有研究認為，高三尖杉酯堿抗腫瘤活性主要與抑制蛋白合成和誘導凋亡兩大機制有關(guān)。但是，這些研究都不能回答該藥物直接作用的靶蛋白是什么。
　　因此，為了進一步明確該藥的具體作用機制，我們在本研究中制備了高三尖杉酯堿親和柱，通過親和柱結(jié)合白血病細胞蛋白來尋找藥物直接結(jié)合的靶蛋白;并通過

3、建立靶蛋白高表達的細胞系，采用表達譜芯片技術(shù)、實時定量PCR以及免疫印跡等手段與方法來探討高三尖杉酯堿通過靶蛋白發(fā)揮抗白血病作用的可能分子機制。
　　方法:
　　1. 細胞培養(yǎng):
　　(1)人白血病細胞培養(yǎng):髓系白血病細胞系Kasumi-1、單核細胞白血病細胞系THP1和U937、慢性髓系白血病細胞系K562;
　　(2)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞:經(jīng)改造后用于逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的293細胞系Plat-GP細胞。
　　

4、2. 細胞增殖活力檢測:MTS法
　　3. 細胞周期檢測:流式細胞技術(shù)
　　4. 細胞凋亡檢測:流式細胞技術(shù)，PI/Annexin-Ⅴ標記物染色法檢測。
　　5. 親和柱制備:采用鏈親和素瓊脂糖親和樹脂以及生物素進行制備，經(jīng)色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測。
　　6. 蛋白洗脫與鑒定:采用PBS、NaCl及高三尖杉酯堿溶液洗脫，純化干燥后獲得蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后染色，切割并消化蛋白條帶后，通過蛋白質(zhì)譜技術(shù)對靶蛋白進行分

5、析鑒定。
　　7. 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株:采用逆轉(zhuǎn)錄病毒進行轉(zhuǎn)染實驗，通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株，并經(jīng)過western blot驗證。
　　8. 表達譜芯片分析:采用Affymetrix GeneChip(@) Human Genome U133 Plus2.0Array芯片檢測和分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系靶蛋白高表達后的基因表達譜的變化情況。
　　9. 實時定量PCR:檢測和驗證芯片結(jié)果以及觀察經(jīng)高三尖杉酯堿處理后白血病細胞系的R

6、NA表達變化情況。
　　10. Western blot分析:檢測和驗證芯片結(jié)果以及檢測經(jīng)高三尖杉酯堿作用后白血病細胞系的蛋白表達變化情況。
　　結(jié)果:
　　1. 高三尖杉酯堿對急性髓系白血病細胞系THP1、U937、和Kasumi-1細胞以及慢性髓系白血病細胞系K562有明顯的生長抑制作用，作用48小時的IC50值分別為22.37 ng/ml、11.09 ng/ml、14.93 ng/ml和37.38 ng/ml。<

7、br>　　2. 高三尖杉酯堿能夠誘導人細胞白血病細胞系發(fā)生凋亡，藥物作用后凋亡細胞百分比明顯上升。
　　3. 高三尖酯堿親和柱結(jié)合的直接靶蛋白為actin-結(jié)合蛋白non muscle myosinheavy chainⅡA（NMHCⅡA），并且高三尖杉酯堿作用后可上調(diào)其在細胞中的表達水平。
　　4. 表達譜芯片結(jié)果提示，白血病細胞系穩(wěn)定高表達NMHCⅡA蛋白后，可引起基因表達譜發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為細胞周期和MAPK激酶通路

8、相關(guān)基因表達水平的上調(diào)。
　　5. 實時定量PCR和Western Blot實驗結(jié)果與表達譜芯片結(jié)果基本符合，主要表現(xiàn)為NMHCⅡA蛋白高表達后，細胞周期相關(guān)蛋白（主要為G1期→S期轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白）的上調(diào)，以及高三尖杉酯堿作用后細胞MAPK激酶通路上c-jun和JNK的激活和上調(diào)，可能由此促發(fā)凋亡程序的啟動。
　　結(jié)論:
　　1. 高三尖杉酯堿能夠抑制白血病細胞系的生長與增殖，并且促進腫瘤細胞凋亡的發(fā)生。
　　2.