非酯化脂肪酸在THP-1源性泡沫細胞形成過程中的作用研究.pdf

1、動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）以大、中動脈內(nèi)膜形成含膽固醇、類脂質(zhì)等物質(zhì)的粥樣斑塊為特征。在AS形成過程中，血管內(nèi)皮下巨噬細胞（macrophage）逐漸吞噬細胞外脂質(zhì)并形成泡沫細胞（foamcell），這是AS發(fā)生發(fā)展過程中的重要組成部分。在肥胖人群中，血液中非酯化脂肪酸（non-esterifiedfattyacid，NEFA）含量的升高對AS和急性冠狀動脈綜合癥的發(fā)生有著重要的影響。在健康志愿者和2型糖尿病病

2、人血液中，NEFA的升高有助于巨噬細胞的激活，并進一步促進AS的發(fā)展。根據(jù)脂肪酸鏈的飽和程度分類，NEFA主要分為飽和脂肪酸（saturatedfattyacid，SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturatedfattyacid，MUFA）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid，PUFA）。NEFA能夠在泡沫細胞生成過程中調(diào)節(jié)一系列相關(guān)基因的表達變化。
　　人體內(nèi)的NEFA多來源于食物中的脂類

3、物質(zhì)。最具有代表性的游離脂肪酸包括：棕櫚酸（palmiticacid，PA）、油酸（oleicacid，OA）、亞油酸（linoleicacid，LA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoicacid，EPA）。它們富含于牛奶（PA），植物油（OA，LA）和魚油（EPA）中。上述四種NEFA在鏈長和飽和度上均不相等。PA（16:0），OA（18:1n-9）和LA（18:2n-6）在人AS脂紋及斑塊中含量豐富；LA和EPA（20:

4、5n-3）為具有代表性的兩種PUFA。
　　AS主要涉及巨噬細胞對甘油三酯（Triglyceride，TG）、膽固醇及其酯的吸收與外排，與之相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達水平發(fā)生變化。PPARγ/LXR-α/ABCA1信號通路相關(guān)分子，如PPARγ、ABCA1及清道夫受體（scavengerreceptor）等已經(jīng)被證實能夠影響巨噬細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。
　　泡沫細胞內(nèi)脂滴主要以TG、膽固醇及其酯為核心，表面覆蓋單層磷脂結(jié)

5、構(gòu)，并鑲嵌著多種脂滴相關(guān)蛋白（lipiddropletassociatedprotein）。脂滴相關(guān)蛋白對脂滴代謝及其功能發(fā)揮起到了關(guān)鍵的作用。我們實驗室既往研究已經(jīng)證實了誘導(dǎo)細胞死亡的DFF45樣效應(yīng)因子（celldeath-inducingDFF45-likeeffector，CIDE）家族和Perilipin-ADRP-TIP47（Perilipin-ADRP-TIP47，PAT）家族成員在泡沫細胞形成過程中的表達水平變化顯著，提

6、示其參與了AS形成的調(diào)控過程。在NEFA干預(yù)下，泡沫細胞內(nèi)脂質(zhì)的儲積、外排以及該過程的具體調(diào)控機制目前尚不十分清楚。
　　針對AS的發(fā)生發(fā)展過程，用體外細胞系模擬AS泡沫細胞形成過程，并檢測NEFA作用下細胞脂質(zhì)代謝情況的變化將對進一步了解AS的發(fā)病機制提供一定的參考意義。
　　【目的】：
　　1．體外培養(yǎng)人單核細胞淋巴瘤細胞（THP-1細胞）并誘導(dǎo)分化成泡沫細胞，模擬體內(nèi)AS泡沫細胞形成過程；
　　2．NEFA

7、預(yù)處理THP-1源性巨噬細胞，找出NEFA孵育巨噬細胞的最佳時間和劑量；
　　3．形態(tài)學(xué)觀察和測定NEFA干預(yù)下的泡沫細胞中脂滴形態(tài)及相對面積變化；
　　4．檢測并對比分析泡沫細胞中總膽固醇（Totalcholesterol，TC）和TG的含量；
　　5．檢測在THP-1源性泡沫細胞形成過程中脂滴相關(guān)蛋白在mRNA水平上的變化并加以分析。
　　6．比較分析不同類型的脂肪酸在AS泡沫細胞形成中發(fā)揮的的具體作用和可能

8、的機制。
　　【方法】：
　　1．使用佛波酯（phorbolmyristateacetate，PMA）孵育THP-1細胞48h誘導(dǎo)生成巨噬細胞，再加入氧化型低密度脂蛋白（oxidized-lipoprotein，ox-LDL）繼續(xù)誘導(dǎo)48h，最終形成泡沫細胞；
　　2．使用MTT法檢測在不同時間和劑量梯度下NEFA對巨噬細胞生存率的影響，繪制生存曲線；
　　3．油紅O染色巨噬細胞/泡沫細胞內(nèi)脂滴，觀察脂滴形態(tài)并采

9、圖，使用Image-ProPlus6.0軟件測量各NEFA處理組及空白對照組的細胞內(nèi)脂滴相對面積；
　　4．使用Wako生化檢測試劑盒檢測泡沫細胞中的TG和TC含量；
　　5．Real-timePCR方法檢測THP-1源性巨噬細胞和泡沫細胞在NEFA作用下脂代謝轉(zhuǎn)錄因子及脂滴相關(guān)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。
　　【結(jié)果】：
　　1．NEFA在濃度為100μM，時間為72h的條件下能夠發(fā)揮較好的孵育效果，細胞生存狀態(tài)

10、良好。NEFA的干預(yù)能夠使泡沫細胞中脂質(zhì)含量增多，但是PUFA處理組的細胞脂質(zhì)蓄積量少于PA及OA處理組，脂滴相對總面積較小，細胞內(nèi)的TC含量也較少。PUFA處理組PPARγ，CD36和SR-AI水平上調(diào)，同時ABCA1水平升高。
　　2．脂滴相關(guān)蛋白CIDE和PAT家族成員mRNA檢測結(jié)果顯示：在PUFA處理組中，perilipin和Cidec等包被于成熟脂滴表面的蛋白水平降低，TIP47和ADRP等主要出現(xiàn)于未成熟脂滴表面的蛋