PannexiN-1通道在LPS誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細胞ATP釋放及脂質(zhì)蓄積中的作用.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種由多因素誘導(dǎo)的,以大中動脈血管為主的慢性炎癥反應(yīng)疾病,嚴重影響著人們的身體健康及生活質(zhì)量,已成為心血管疾病發(fā)病的主要誘因。通道蛋白作為維持細胞正常生命活動的重要元素,與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Pannexins(Panx)蛋白家族是一種膜通道蛋白,其中Pannexin-1蛋白為該通道蛋白在組織和細胞中的主要表達形式。研究認為Pannexin-1寡聚體可以形成膜通道,當通道開

2、放時可允許分子量小于1kDa的離子或分子通過,包括腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)等一些小分子物質(zhì)。ATP作為一種重要的細胞信號分子,同樣在調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化形成和發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用,如促進巨噬細胞釋放炎性細胞因子、調(diào)節(jié)巨噬細胞對脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運,影響泡沫細胞形成等過程。然而,由Pannexin-1蛋白寡聚體組成的膜通道,能否調(diào)控脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)巨噬細胞釋

3、放ATP尚未見報道。因此,本課題目的在于研究Pannexin-1通道能否作為LPS誘導(dǎo)巨噬細胞釋放ATP的途徑,并且初步探討Pannexin-1通道對巨噬細胞攝取氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)的調(diào)節(jié)作用,為預(yù)防和治療動脈粥樣硬化疾病開拓新思路提供新靶點。
　　方法:
　　1.采用佛波酯（Phorbol12-myristate13-acetate,PMA）誘

4、導(dǎo)分化THP-1使其成為THP-1源性巨噬細胞,并經(jīng)細胞形態(tài)學及CD14 mRNA的表達情況對巨噬細胞進行鑒定。
　　2.采用RT-PCR和qPCR技術(shù)檢測THP-1細胞中Pannexin-1 mRNA的表達水平,并進一步分析細胞誘導(dǎo)前后以及LPS刺激對Pannexin-1 mRNA表達變化的影響。
　　3.采用螢光素酶法檢測LPS刺激和應(yīng)用Pannexin-1通道抑制劑后細胞釋放ATP含量的變化。
　　4.采用熒光顯

5、微鏡拍攝巨噬細胞攝取Dil-ox-LDL后的熒光圖片,并使用圖像分析軟件(Image-pro plus v6.0)對熒光圖片進行分析,計算出對應(yīng)圖片的平均熒光強度,用以衡量細胞攝取Dil-ox-LDL量的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.THP-1細胞經(jīng)160nM PMA誘導(dǎo)分化24小時后,細胞形態(tài)由分化前的圓形,懸浮生長,變?yōu)樗笮突蜷L梭型,并有大量的偽足出現(xiàn),呈貼壁生長;基因水平檢測結(jié)果顯示,THP-1經(jīng)誘導(dǎo)分化為THP-1

6、源性巨噬細胞后,THP-1源性巨噬細胞中CDI4 mRNA表達水平明顯上調(diào),與THP-1細胞相比有顯著性差異（**P＜0.01）;RT-PCR和qPCR結(jié)果顯示,在THP-1細胞中Pannexin-1 mRNA表達豐富,細胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化后,THP-1源性巨噬細胞中的Pannexin-1 mRNA表達量較對照組明顯增加（**P＜0.01）,并且THP-1源性巨噬細胞經(jīng)1μg/mL LPS刺激4小時后,Pannexin-1 mRNA表達

7、水平較未刺激組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義（##P＜0.01）。
　　2.THP-1源性巨噬細胞經(jīng)1μg/mL LPS刺激不同時間(0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min)后,LPS刺激組各時間點細胞釋放的ATP含量較對照組顯著增加（**P＜0.01）,并且LPS刺激5分鐘時達到高峰;當使用Pannexin-1通道抑制劑生胃酮（CBX;100μM）預(yù)處理細胞30分鐘后,再用LPS刺激細胞5分鐘

8、,檢測細胞釋放ATP含量變化情況。結(jié)果顯示,使用CBX后細胞釋放ATP的含量較LPS刺激組明顯減少（**P＜0.01）;同樣,以Pannexin-1通道特異性抑制（10Panx1;200μM）預(yù)處理細胞30分鐘,檢測結(jié)果顯示10Panx1明顯的抑制了由LPS誘導(dǎo)的ATP釋放效應(yīng),ATP釋放量較LPS刺激組明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義（##P＜0.01）。
　　3.巨噬細胞吞噬實驗結(jié)果顯示,1μg/mL LPS刺激THP-1源性巨噬細

9、胞4小時后,能夠明顯的促進細胞對Dil-ox-LDL的攝取,較對照組相比具有顯著性差異（**P＜0.01）;當預(yù)先以Pannexin-1通道抑制劑CBX(100μM)或10Panx1（200μM）預(yù)處理細胞30分鐘,再用LPS刺激細胞4小時,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑組可以減弱細胞對Dil-ox-LDL的攝取,與LPS刺激組相比有顯著性差異（##P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.Pannexin-1通道可調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)THP-1源性