Wnt拮抗劑SFRP1在胃腸道腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、本文將進(jìn)一步探討分泌型frizzled相關(guān)蛋白1(SFRP1)表達(dá)下調(diào)與胃腸道腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力之間的相關(guān)性。通過檢測(cè)MMP-2和MMP-9水平，探討其具體機(jī)制。 研究材料與方法： 1、研究材料： 胃癌及相應(yīng)的癌旁組織各52例，結(jié)直腸癌及相應(yīng)的癌旁組織各60例，均來自于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院。標(biāo)本獲取后即冷凍于液氮之中。人類胃癌細(xì)胞系SGC-7901，BGC-823和HGC-27，結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW-4

2、80均購(gòu)自上海昆肯生物化工有限公司。Trizol試劑、RNA PCR試劑盒和LightCycler DNA MasterSYBR Green I試劑盒，購(gòu)自于寶生物公司。GENMED基因甲基化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于上海杰美公司。SFRP1、MMP-2和MMP-9多克隆抗體購(gòu)自于美國(guó)SANTACRUZ公司。 2、研究方法： 人類胃癌細(xì)胞系SGC-7901、BGC-823、HGC-27，結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW-480均培養(yǎng)于

3、RPMI 1640中，添加10％肽牛血清，青霉素(100IU/ml)及鏈霉素(100μg/ml)。采用飽和氯化鈉法進(jìn)行DNA提取。采用Trizol法進(jìn)行RNA提取。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)進(jìn)行SFRP1 mRNA定性檢測(cè)。采用即時(shí)定量PCR檢測(cè)MMP-2和MMP-9mRNA表達(dá)。采用甲基化特異性PCR(MsP)檢測(cè)SFRP1基因甲基化狀態(tài)。采用Western blotting檢測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)。 3、統(tǒng)計(jì)

4、學(xué)分析腫瘤組織與癌旁組織比較采用卡方檢驗(yàn)；腫瘤細(xì)胞之間的比較采用t檢驗(yàn)；SFRP1表達(dá)與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性分析采用Fisher’s精確檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1、胃癌細(xì)胞系SFRP1甲基化狀態(tài)及表達(dá)狀態(tài)胃癌細(xì)胞BGC-823和HGC-27存在SFRP1基因甲基化，而SGC-7901未檢出SFRPl基因甲基化。SGC-7901存在SFRP1 mRNA表達(dá)，而BGC-823和HGC-27未檢

5、出表達(dá)。采用去甲基化試劑5-氮雜-脫氧胞苷酸(5-aza-2’-deoxycytidine)對(duì)BGC-823和HGC-27進(jìn)行處理后，SFRP1 mRNA重新出現(xiàn)表達(dá)。 2、胃癌標(biāo)本及癌旁組織中SFRPl甲基化狀態(tài)及表達(dá)狀態(tài)在52例胃癌中，23例存在SFRP1基因甲基化現(xiàn)象。在其相應(yīng)的癌旁組織中，8例檢出SFRPl甲基化，兩者差異顯著(P<0.01)。17例胃癌存在SFRP1表達(dá)消失。在其相應(yīng)的癌旁組織中，6例表達(dá)消失，兩者差異

6、顯著(P<0.01)。SFRP1表達(dá)消失與SFRP1基因甲基化具有顯著相關(guān)性(P<0.001)。 3、結(jié)腸癌細(xì)胞系SFRP1甲基化狀態(tài)及表達(dá)狀態(tài)結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480檢出SFRP1基因甲基化，而HT-29未檢出SFRP1基因甲基化。HT-29存在SFRP1 mRNA表達(dá)，而SW-480未檢出表達(dá)。采用去甲基化試劑5-氮雜-脫氧胞苷酸對(duì)SW-480進(jìn)行處理后，SFRP1 mRNA重新出現(xiàn)表達(dá)。 4、結(jié)腸癌標(biāo)本及癌旁組織中S

7、FRP1甲基化狀態(tài)及表達(dá)狀態(tài)在60例結(jié)直腸癌中，38例存在SFRP1基因甲基化現(xiàn)象。在其相應(yīng)的癌旁組織中，11例檢出SFRP1甲基化，兩者差異顯著(P<0.01)。35例結(jié)直腸癌存在SFRP1表達(dá)消失。在其相應(yīng)的癌旁組織中，8例表達(dá)消失，兩者差異顯著(P<0.01)。SFRP1表達(dá)消失與SFRP1基因甲基化具有顯著相關(guān)性(P<0.001)。 5、SFRP1表達(dá)消失與胃癌、結(jié)腸癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性SFRP1表達(dá)消失與胃癌

8、患者年齡、性別、腫瘤大小及組織類型均無(wú)相關(guān)性，而與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性。SFRP1表達(dá)消失與結(jié)直腸患者年齡、性別、腫瘤大小均無(wú)相關(guān)性，而與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性。 6、胃癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)在胃癌細(xì)胞系中，SGC-7901表達(dá)低水平MMP-2和MMP-9 mRNA，而BGC-823表達(dá)高水平MMP-2和MMP-9 mRNA，兩者差異顯著(P<0.01))。在結(jié)腸癌細(xì)胞系中

9、，HT-29表達(dá)低水平的MMP-2和MMP-9 mRNA，而SW-480表達(dá)高水平MMP-2和MMP-9 mRNA，兩者差異顯著(P<0.01))。 7、胃癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)在胃癌細(xì)胞系中，SGC-7901表達(dá)低水平MMP-2和MMP-9蛋白，而BGC-27表達(dá)高水平的MMP-2和MMP-9蛋白。結(jié)腸癌細(xì)胞系中HT-29表達(dá)低水平MMP-2和MMP-9蛋白，而SW-480表達(dá)高水平的MMP-2和MMP

10、-9蛋白。 8、胃癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系經(jīng)去甲基化處理后檢測(cè)采用去甲基化試劑5-氮雜-脫氧胞苷酸處理胃癌細(xì)胞系BGC-27和結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480后，發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9 mRNA水平均較處理前顯著降低(P<0.01)． 研究結(jié)論： (1)SFRP1在部分胃癌中表達(dá)消失，其機(jī)制主要由SFRP1基因甲基化所致。結(jié)果提示，SFRP1表達(dá)消失與部分胃癌發(fā)病有關(guān)。 (2)SFRP1在部分結(jié)直腸癌中表達(dá)消失，且其機(jī)