大鼠神經(jīng)上皮干細(xì)胞移植治療無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的實驗研究.pdf

1、本文設(shè)計了該項研究課題，即在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的大鼠模型上，探討神經(jīng)上皮干細(xì)胞移植治療無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的可行性，為該病的治療開辟一條新路。實驗分三部分進行： 第一部分神經(jīng)上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和體外標(biāo)記神經(jīng)上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和體外標(biāo)記是進行干細(xì)胞移植的前提條件。經(jīng)多次試驗，我們成功地摸索出了一個分離培養(yǎng)、體外標(biāo)記神經(jīng)上皮干細(xì)胞的最佳方案。從孕11.5天的Wistar大鼠胚胎中分離神經(jīng)管，機械吹打后獲得單細(xì)胞懸液，接種于

2、無血清培養(yǎng)基DMEM/F12(含B27)，并加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子靜置培養(yǎng)。72小時后開始出現(xiàn)許多十幾個細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞團，呈懸浮狀態(tài)，即神經(jīng)球。第6天每個細(xì)胞集落由幾十甚至幾百個細(xì)胞聚集形成，Nestin染色呈強陽性。將神經(jīng)球置于含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)7天后進行微管相關(guān)蛋白2和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色，染色結(jié)果顯示，神經(jīng)上皮干細(xì)胞能分化為MAP2陽性的神經(jīng)細(xì)胞及GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞。通

3、過進一步的RT-PCR檢測，顯示培養(yǎng)的神經(jīng)上皮干細(xì)胞在體外表達腸神經(jīng)營養(yǎng)因子受體系統(tǒng)rearranged during transformation(RET)receptor tyrosine kinase和GFRα1，說明這種細(xì)胞可接受腸壁環(huán)境中的生長因子信號的調(diào)控，更有利于移植后向腸神經(jīng)細(xì)胞方向分化。為了移植后可以在體內(nèi)示蹤，我們在體外對細(xì)胞進行了5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記，于移植前3d在細(xì)胞中摻入BrdU，經(jīng)BrdU免疫細(xì)胞化

4、學(xué)染色，神經(jīng)球中有大約90％的細(xì)胞呈BrdU陽性，為下一步的移植實驗提供了良好的示蹤標(biāo)記細(xì)胞的方法。 第二部分無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病動物模型的建立建立無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的動物模型是進行細(xì)胞移植治療實驗研究的基本條件。為此，我們根據(jù)無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的病理變化，以大鼠為實驗動物，選用陽離子表面活性劑-芐基-二甲基-十四烷基氯化銨作為神經(jīng)細(xì)胞的選擇性滅活劑，作用于大鼠的遠(yuǎn)段結(jié)腸漿膜表面，選擇性的滅活腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，成功地建立了

5、該病的動物模型。術(shù)后4周大體解剖發(fā)現(xiàn)，BAC作用處腸管痙攣狹窄，其上方腸管擴張、腸內(nèi)容物潴留；結(jié)腸測壓球囊擴張刺激反射實驗顯示無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段結(jié)腸的反射性收縮消失；HE染色、免疫熒光染色及組織化學(xué)染色證實，BAC作用處肌間和粘膜下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞消失，乙酰膽堿酯酶的活性明顯減低；Western blot也證實神經(jīng)型一氧化氮合酶和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達明顯降低。證明了該動物模型與人類的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病類似，為進一步研究該病的發(fā)病機理和治療方法

6、提供了適宜的動物模型。 第三部分無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸壁內(nèi)神經(jīng)上皮干細(xì)胞的移植和移植后的檢測在成功建立動物模型的基礎(chǔ)上，我們進行了神經(jīng)上皮干細(xì)胞的移植。取BrdU標(biāo)記的第5代的神經(jīng)上皮干細(xì)胞，移植到模型鼠去除腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的腸段。移植4周時檢測發(fā)現(xiàn)，移植細(xì)胞存活良好，并部分分化為蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gerle product 9.5，PGP9.5)陽性的神經(jīng)細(xì)胞和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。移植8周后移植細(xì)胞分化成為nNO

7、S及ChAT陽性的神經(jīng)細(xì)胞。結(jié)腸測壓球囊擴張刺激反射實驗顯示細(xì)胞移植后腸神經(jīng)反射性收縮恢復(fù)，腸離體肌條試驗結(jié)果也表明神經(jīng)上皮干細(xì)胞移植組結(jié)腸較未移植細(xì)胞的模型組結(jié)腸有明顯的EFS誘導(dǎo)的舒張或收縮反應(yīng)。這提示神經(jīng)上皮干細(xì)胞在腸壁的微環(huán)境中可以存活，并分化為功能性的腸神經(jīng)細(xì)胞，而且可恢復(fù)無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞結(jié)腸段的神經(jīng)運動功能。結(jié)論本項研究成功地分離培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記了神經(jīng)上皮干細(xì)胞，成功地建立了無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的大鼠模型，并成功地進行了腸壁內(nèi)

8、干細(xì)胞移植，通過移植后的檢測，證明了移植細(xì)胞在腸壁中能夠分化成功能性的腸神經(jīng)細(xì)胞，并能恢復(fù)腸神經(jīng)運動功能。這表明神經(jīng)干細(xì)胞腸壁內(nèi)移植有望成為治療無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的新方法。 目的：將神經(jīng)上皮干細(xì)胞(neuroepithelial stem cells，NESCs)移植到模型鼠無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的腸壁內(nèi)，觀察NESCs存活分化及對腸神經(jīng)運動功能改善的情況。 方法：從孕11.5天大鼠胚胎神經(jīng)管中分離、培養(yǎng)NESCs，用5-溴-

9、2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記細(xì)胞。用化學(xué)試劑芐基-二甲基-十四烷基氯化銨(benzalkonium chloride，BAC)選擇性去除大鼠一段結(jié)腸壁內(nèi)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞建立無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的動物模型，4周后將標(biāo)記的NESCs注入無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的腸壁內(nèi)。分別于移植后的2周、4周和8周處死大鼠，通過免疫熒光雙染觀察移植細(xì)胞的存活、分化情況，并進行結(jié)腸測壓球囊擴張刺激反射實驗和腸壁離體肌條的

10、電場刺激(electrical field stimulation，EFS)實驗來觀察移植后神經(jīng)調(diào)節(jié)的腸運動功能的恢復(fù)情況。 結(jié)果：NESCs移植后2周可見移植細(xì)胞在體內(nèi)存活良好呈未分化狀態(tài)，4周可檢測到移植細(xì)胞分化為PGP9.5陽性的成熟神經(jīng)細(xì)胞和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，8周可檢測到移植細(xì)胞分化成神經(jīng)性一氧化氮合酶(nNOS)及乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)陽性的有神經(jīng)內(nèi)分泌功能的腸神經(jīng)細(xì)胞。移植后8周測壓結(jié)果顯示模型組結(jié)腸對

11、球囊擴張刺激的神經(jīng)反射消失，而細(xì)胞移植組結(jié)腸的神經(jīng)反射功能明顯恢復(fù)；腸離體肌條生理實驗結(jié)果顯示模型組結(jié)腸對EFS無反應(yīng)，而EFS可引起細(xì)胞移植組結(jié)腸舒張或收縮反應(yīng)，表明NESCs移植后結(jié)腸的腸神經(jīng)運動功能有明顯的恢復(fù)。 結(jié)論：NESCs在無神經(jīng)節(jié)腸壁內(nèi)可以存活和分化，并能恢復(fù)腸神經(jīng)運動功能，因此移植NESCs為無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病開辟了細(xì)胞移植治療的新途徑。 目的：用化學(xué)方法選擇性去除大鼠腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，建立類似于人類無

12、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的大鼠模型。 方法：體重為200g左右的Wistar大鼠60只，隨機分為兩組：(1)模型組(30只)，(2)對照組(30只)。模型組通過開腹手術(shù)將0.5％的芐基-二甲基-十四烷基氯化銨(benzalkonium chloride，BAC)作用于大鼠降結(jié)腸遠(yuǎn)端2cm長的腸管漿膜表面30分鐘，用生理鹽水作對照組。術(shù)后4周，觀察作用部位的大體解剖變化，并進行結(jié)腸測壓球囊擴張刺激反射實驗檢測腸神經(jīng)反射功能。取處理段結(jié)

13、腸行病理學(xué)檢查，通過冰凍切片的HE染色、PGP9.5免疫熒光染色和乙酰膽堿酯酶(AchE)組織化學(xué)染色觀察局部腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)纖維的消除情況。同時通過Western blot檢測神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)這兩種腸神經(jīng)遞質(zhì)合成酶的表達情況。 結(jié)果：術(shù)后4周的大體解剖發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠BAC作用處的腸管痙攣狹窄，其上方腸管擴張、腸內(nèi)容物潴留；處理段結(jié)腸對近端結(jié)腸擴張刺激的反射性收縮消失；組織學(xué)檢查證實

14、，BAC作用處肌間和粘膜下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞消失，AchE的活性明顯減低；Western blot也證實nNOS和ChAT的表達明顯降低。 結(jié)論：用BAC選擇性去除腸神經(jīng)的方法成功地建立了無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的大鼠模型，為進一步研究該病的發(fā)病機理、病理生理改變和治療方法提供了適宜的動物模型。 目的：從胚胎大鼠神經(jīng)管中分離出神經(jīng)上皮干細(xì)胞進行培養(yǎng)擴增，觀察其在體外的表型及分化特性，并進行體外標(biāo)記示蹤，為進一步的移植研究提供細(xì)胞基

15、礎(chǔ)。 方法：采用顯微解剖、機械吹打、無血清懸浮培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)神經(jīng)上皮干細(xì)胞，通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色及RT-PCR技術(shù)，檢測神經(jīng)上皮干細(xì)胞巢蛋白(Nestin)、腸神經(jīng)營養(yǎng)因子受體系統(tǒng)rearranged during transformation(RET)receptor tyrosine kinase、GFRα1(GDNF family receptorα1)以及分化后神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志抗原MAP2(microt

16、ubule associated protein2)、GFAP(glial fibrillary acidic protein)的表達。采用5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記神經(jīng)上皮干細(xì)胞，觀察標(biāo)記率及標(biāo)記的穩(wěn)定性。 結(jié)果：無血清培養(yǎng)72小時后出現(xiàn)許多十幾個細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞團，邊界清楚，折光性強，呈懸浮狀態(tài)，即神經(jīng)球。第6天每個細(xì)胞集落由幾十甚至幾百個細(xì)胞聚集形成。原代和傳

17、代培養(yǎng)的神經(jīng)球呈Nestin抗原陽性，RT-PCR結(jié)果顯示神經(jīng)球來源的mRNA呈RET及GFRα1陽性。經(jīng)傳代有血清培養(yǎng)后神經(jīng)球中的細(xì)胞分化為MAP2陽性的神經(jīng)細(xì)胞和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)標(biāo)記后的神經(jīng)球中約90％的細(xì)胞呈BrdU陽性，神經(jīng)球分化后形成的神經(jīng)細(xì)胞也呈BrdU陽性。 結(jié)論：分離自胎鼠神經(jīng)管的神經(jīng)上皮干細(xì)胞是增殖能力很強的神經(jīng)干細(xì)胞，并具有分化為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的潛能；能表達腸營養(yǎng)因子受體系統(tǒng)，