GFP轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)上皮干細(xì)胞紋狀體內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)是一類具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞，是神經(jīng)系統(tǒng)的原始細(xì)胞，可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在體內(nèi)和體外特定的微環(huán)境中均可誘導(dǎo)分化成特定遞質(zhì)類型的神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞良好的生物學(xué)特性引起了眾多神經(jīng)科學(xué)研究者的研究興趣，在神經(jīng)移植領(lǐng)域，越來越多的研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞可以作為細(xì)胞替代治療中良好的供體細(xì)胞，移植后可以替代退變或損傷的神經(jīng)元，不同程度地恢復(fù)病變部位原有的功能，為發(fā)育不良

2、性腦病及神經(jīng)退行性疾病的治療帶來了希望。 神經(jīng)上皮干細(xì)胞(Neuroepithelial stem cell，NEP)起源于胚胎神經(jīng)板和神經(jīng)管，構(gòu)成了神經(jīng)系統(tǒng)的原基，是最原始的神經(jīng)干細(xì)胞。我們實(shí)驗(yàn)室以前的研究以及最近的實(shí)驗(yàn)均表明神經(jīng)上皮干細(xì)胞具有活躍的增殖能力，體內(nèi)移植后可以分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在這些研究中，由于受到標(biāo)記方法的限制，難以對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行追蹤觀察和確認(rèn)，對(duì)臨床療效的確定也缺乏有力的直接證據(jù)。綠色熒光蛋白(Gr

3、een fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因鼠是將GFP基因融合到小鼠的遺傳基因中，能夠在小鼠的所有體細(xì)胞中長(zhǎng)久而穩(wěn)定的表達(dá)。從GFP轉(zhuǎn)基因鼠胚胎神經(jīng)管取材的GFP陽(yáng)性神經(jīng)上皮干細(xì)胞可以在熒光顯微鏡下檢測(cè)到綠色熒光，體內(nèi)移植后可方便、直觀地區(qū)分供體細(xì)胞與宿主細(xì)胞，具有較高的靈敏度和分辨率。從GFP轉(zhuǎn)基因鼠胚胎神經(jīng)管取材神經(jīng)上皮干細(xì)胞進(jìn)行紋狀體內(nèi)移植的研究鮮有報(bào)道。 目的:以臨床應(yīng)用為最終目的的神經(jīng)干細(xì)胞腦內(nèi)移植

4、的研究已成為干細(xì)胞研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞在移植部位能否長(zhǎng)期存活、能否分化為所需要的神經(jīng)元等問題是這一研究領(lǐng)域的難點(diǎn)。為檢測(cè)和觀察胚胎神經(jīng)管來源的神經(jīng)上皮干細(xì)胞腦內(nèi)移植后存活及分化的情況，我們采用GFP轉(zhuǎn)基因鼠的早期胚胎來源的神經(jīng)上皮干細(xì)胞，經(jīng)體外純化、擴(kuò)增后，定向移植到大鼠的紋狀體內(nèi)，術(shù)后不同時(shí)間取材、切片，在熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞的存活與分化狀況，并與其體外自然分化狀況相比較。從而為胚胎神經(jīng)上皮干細(xì)胞紋狀體內(nèi)移植治療帕金森病的

5、可行性提供直觀、確切的證據(jù)。 方法:將GFP轉(zhuǎn)基因鼠胚胎神經(jīng)管取材的神經(jīng)上皮干細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基(成份：DMEM/F<,12>+B<,27>+bFGF，其中，B<,27>：1：50；bFGF：10μg/ml)內(nèi)進(jìn)行純化、擴(kuò)增；用神經(jīng)巢蛋白(nestin)染色進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的特異性鑒定；繼而用含10％胎牛血清的干細(xì)胞分化培養(yǎng)液進(jìn)行分化培養(yǎng)，體外培養(yǎng)7天后行微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein

6、-2，MAP-2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)特異性免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以觀察神經(jīng)上皮干細(xì)胞在有血清培養(yǎng)中自然分化的趨向；將培養(yǎng)擴(kuò)增后的含GFP基因的神經(jīng)上皮干細(xì)胞在立體定位儀下定向移植到大鼠的紋狀體內(nèi)，術(shù)后不同時(shí)間取材、切片，在熒光顯微鏡下檢測(cè)移植細(xì)胞的存活狀況，行微管相關(guān)蛋白(MAP-2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋

7、白(GFAP)以及酪氨酸羥化酶(TH)特異性免疫組織化學(xué)染色，以檢測(cè)神經(jīng)上皮干細(xì)胞在紋狀體微環(huán)境內(nèi)向多巴胺能神經(jīng)元定向分化的狀況，從而為神經(jīng)上皮干細(xì)胞紋狀體內(nèi)移植治療帕金森病的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 結(jié)果:(1)GFP轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)管來源的神經(jīng)上皮干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)可見細(xì)胞分裂相，3天時(shí)可見數(shù)量較多、形體較小、呈懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球，培養(yǎng)7天的培養(yǎng)瓶中神經(jīng)球的數(shù)量增多、體積變大，直徑可達(dá)100μm。經(jīng)神經(jīng)巢蛋白染色鑒定，

8、增殖形成的神經(jīng)球呈nestin陽(yáng)性；(2)體外擴(kuò)增的GFP轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)上皮干細(xì)胞在含10％胎牛血清的分化培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)7天，可分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其中有少量的TH陽(yáng)性細(xì)胞；(3)體外擴(kuò)增后的GFP轉(zhuǎn)基因鼠來源的神經(jīng)上皮干細(xì)胞移植到紋狀體內(nèi)后存活良好。在術(shù)后2W的組織切片中，移植區(qū)內(nèi)可見成片的綠色熒光細(xì)胞，部分細(xì)胞已經(jīng)開始分化并向周圍伸出突起，有些還遷移到移植區(qū)100μm以外的組織中；在術(shù)后4周的組織切片中，大部分移植細(xì)胞都進(jìn)行了

9、分化，胞體形態(tài)多樣，大小不等，突起較長(zhǎng)，細(xì)胞間已建立了連接。遷移出移植區(qū)的細(xì)胞多沿白質(zhì)排成一列，前后相續(xù)。免疫組織化學(xué)染色表明部分細(xì)胞已經(jīng)分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其中有相當(dāng)多的細(xì)胞呈TH陽(yáng)性，說明神經(jīng)上皮干細(xì)胞在紋狀體內(nèi)能定向分化為多巴胺能神經(jīng)元。 結(jié)論:GFP轉(zhuǎn)基因鼠來源的神經(jīng)上皮干細(xì)胞具有活躍的增殖能力和多向分化潛能；紋狀體內(nèi)移植后存活良好，并能向周圍遷移，在紋狀體局部微環(huán)境的誘導(dǎo)下可分化為多巴胺能神經(jīng)元；移植細(xì)胞在熒光