GFP轉基因鼠神經(jīng)上皮干細胞紋狀體內(nèi)移植的實驗研究.pdf

1、神經(jīng)干細胞(Neural stem cells，NSCs)是一類具有自我更新及多向分化潛能的細胞，是神經(jīng)系統(tǒng)的原始細胞，可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，在體內(nèi)和體外特定的微環(huán)境中均可誘導分化成特定遞質(zhì)類型的神經(jīng)細胞。神經(jīng)干細胞良好的生物學特性引起了眾多神經(jīng)科學研究者的研究興趣，在神經(jīng)移植領域，越來越多的研究表明，神經(jīng)干細胞可以作為細胞替代治療中良好的供體細胞，移植后可以替代退變或損傷的神經(jīng)元，不同程度地恢復病變部位原有的功能，為發(fā)育不良

2、性腦病及神經(jīng)退行性疾病的治療帶來了希望。 神經(jīng)上皮干細胞(Neuroepithelial stem cell，NEP)起源于胚胎神經(jīng)板和神經(jīng)管，構成了神經(jīng)系統(tǒng)的原基，是最原始的神經(jīng)干細胞。我們實驗室以前的研究以及最近的實驗均表明神經(jīng)上皮干細胞具有活躍的增殖能力，體內(nèi)移植后可以分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞。在這些研究中，由于受到標記方法的限制，難以對移植細胞進行追蹤觀察和確認，對臨床療效的確定也缺乏有力的直接證據(jù)。綠色熒光蛋白(Gr

3、een fluorescent protein，GFP)轉基因鼠是將GFP基因融合到小鼠的遺傳基因中，能夠在小鼠的所有體細胞中長久而穩(wěn)定的表達。從GFP轉基因鼠胚胎神經(jīng)管取材的GFP陽性神經(jīng)上皮干細胞可以在熒光顯微鏡下檢測到綠色熒光，體內(nèi)移植后可方便、直觀地區(qū)分供體細胞與宿主細胞，具有較高的靈敏度和分辨率。從GFP轉基因鼠胚胎神經(jīng)管取材神經(jīng)上皮干細胞進行紋狀體內(nèi)移植的研究鮮有報道。 目的:以臨床應用為最終目的的神經(jīng)干細胞腦內(nèi)移植

4、的研究已成為干細胞研究中的一個熱點。神經(jīng)干細胞在移植部位能否長期存活、能否分化為所需要的神經(jīng)元等問題是這一研究領域的難點。為檢測和觀察胚胎神經(jīng)管來源的神經(jīng)上皮干細胞腦內(nèi)移植后存活及分化的情況，我們采用GFP轉基因鼠的早期胚胎來源的神經(jīng)上皮干細胞，經(jīng)體外純化、擴增后，定向移植到大鼠的紋狀體內(nèi)，術后不同時間取材、切片，在熒光顯微鏡下觀察移植細胞的存活與分化狀況，并與其體外自然分化狀況相比較。從而為胚胎神經(jīng)上皮干細胞紋狀體內(nèi)移植治療帕金森病的

5、可行性提供直觀、確切的證據(jù)。 方法:將GFP轉基因鼠胚胎神經(jīng)管取材的神經(jīng)上皮干細胞置于無血清培養(yǎng)基(成份：DMEM/F<,12>+B<,27>+bFGF，其中，B<,27>：1：50；bFGF：10μg/ml)內(nèi)進行純化、擴增；用神經(jīng)巢蛋白(nestin)染色進行神經(jīng)干細胞的特異性鑒定；繼而用含10％胎牛血清的干細胞分化培養(yǎng)液進行分化培養(yǎng)，體外培養(yǎng)7天后行微管相關蛋白(microtubule-associated protein

6、-2，MAP-2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)特異性免疫細胞化學染色，以觀察神經(jīng)上皮干細胞在有血清培養(yǎng)中自然分化的趨向；將培養(yǎng)擴增后的含GFP基因的神經(jīng)上皮干細胞在立體定位儀下定向移植到大鼠的紋狀體內(nèi)，術后不同時間取材、切片，在熒光顯微鏡下檢測移植細胞的存活狀況，行微管相關蛋白(MAP-2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋

7、白(GFAP)以及酪氨酸羥化酶(TH)特異性免疫組織化學染色，以檢測神經(jīng)上皮干細胞在紋狀體微環(huán)境內(nèi)向多巴胺能神經(jīng)元定向分化的狀況，從而為神經(jīng)上皮干細胞紋狀體內(nèi)移植治療帕金森病的可行性提供實驗依據(jù)。 結果:(1)GFP轉基因鼠神經(jīng)管來源的神經(jīng)上皮干細胞在無血清培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24小時可見細胞分裂相，3天時可見數(shù)量較多、形體較小、呈懸浮生長的神經(jīng)球，培養(yǎng)7天的培養(yǎng)瓶中神經(jīng)球的數(shù)量增多、體積變大，直徑可達100μm。經(jīng)神經(jīng)巢蛋白染色鑒定，

8、增殖形成的神經(jīng)球呈nestin陽性；(2)體外擴增的GFP轉基因鼠的神經(jīng)上皮干細胞在含10％胎牛血清的分化培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)7天，可分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，其中有少量的TH陽性細胞；(3)體外擴增后的GFP轉基因鼠來源的神經(jīng)上皮干細胞移植到紋狀體內(nèi)后存活良好。在術后2W的組織切片中，移植區(qū)內(nèi)可見成片的綠色熒光細胞，部分細胞已經(jīng)開始分化并向周圍伸出突起，有些還遷移到移植區(qū)100μm以外的組織中；在術后4周的組織切片中，大部分移植細胞都進行了

9、分化，胞體形態(tài)多樣，大小不等，突起較長，細胞間已建立了連接。遷移出移植區(qū)的細胞多沿白質(zhì)排成一列，前后相續(xù)。免疫組織化學染色表明部分細胞已經(jīng)分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞，其中有相當多的細胞呈TH陽性，說明神經(jīng)上皮干細胞在紋狀體內(nèi)能定向分化為多巴胺能神經(jīng)元。 結論:GFP轉基因鼠來源的神經(jīng)上皮干細胞具有活躍的增殖能力和多向分化潛能；紋狀體內(nèi)移植后存活良好，并能向周圍遷移，在紋狀體局部微環(huán)境的誘導下可分化為多巴胺能神經(jīng)元；移植細胞在熒光