TNFR2突變載體的構(gòu)建及其對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建腫瘤壞死因子受體2（humantumornecrosisfactorreceptor2，TNFR2）野生型196Met和突變型196Arg的真核表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞中，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，探討TNR2基因多態(tài)性對小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)TNF/TNFR2信號通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響。
　　 方法：1.人工合成TNFR2196MEI目的片段，與載體pMD18-Tsimple連接形成克隆載體，利用快速定

2、點突變PCR技術(shù)，設(shè)計一對引物（包含預(yù)定的突變），通過PCR擴(kuò)增出含突變位點的質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到Ecoli感受態(tài)細(xì)胞中，通過氨芐青霉素抗藥性篩選出成功轉(zhuǎn)化的陽性克隆，進(jìn)行擴(kuò)增抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序鑒定，得到pMD18-Tsimple-TNFR2196ARG。2.用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切測序成功的pMD18-Tsimple-TNFR2196MET、pMD18-Tsimple-TNFR2196ARG；及空質(zhì)粒pcDNA6.0，通過T4

3、連接酶將TNFR2196MET、TNFR2196ARGDNA片段和酶切后的pcDNA6.0連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA6.0-TNFR2196MET和pcDNA6.0-TNFR2196ARG，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli細(xì)胞中，篩選陽性重組子行菌液PCR和雙酶切及測序鑒定。
　　 3.將pcDNA6.0-TNFR2196MET、pcDNA6.0-TNFR2196ARG與pcDNA6.0采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)

4、胞中，轉(zhuǎn)染48h后使用殺稻瘟菌素抗性篩選4周，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，倒置顯微鏡下觀察RAW264.7細(xì)胞的生長狀況及形態(tài)。將培養(yǎng)的細(xì)胞分為4組：空白對照組、pcDNA6.0空質(zhì)粒組、pcDNA6.0_TNFR2196MET組及pcDNA6.0-TNFR2196ARG組。采用RT-PCR法檢測各組TNFR2、cIAP1、cIAP2mRNA的變化；Western印跡法檢測p-JNK的表達(dá)、cIAP1和cIAP2的表達(dá)、TNFR2及NF-κB的

5、表達(dá)；ELISA法檢測細(xì)胞上清液sTNFR2、IL-1β、IL-6的水平。
　　 結(jié)果：1.DNA測序表明重組質(zhì)粒中含有目的片段TNFR2，且插入片段的堿基序列完整，無堿基的丟失，堿基由T成功突變?yōu)镚。
　　 2.酶切測序驗證了成功構(gòu)建了pcDNA6.0-TNFR2196MET和pcDNA6.0-TNFR2196ARG表達(dá)載體。
　　 3.建立了穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6.0-TNFR2196MET和pcDNA6.

6、0-TNFR2196ARG的RAW264.7細(xì)胞株。RT-PCR結(jié)果分析顯示pcDNA6.0-TNFR2196ARG組TNFR2、cIAP1、cIAP2mRNA表達(dá)水平較pcDNA6.0-TNFR2196MET下調(diào)，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示pcDNA6.0-TNFR2196ARGp-JNK、cIAP1和cIAP2、TNFR2及NF-κB蛋白表達(dá)較pcDNA6.0-TNFR2196MET下調(diào)，有統(tǒng)計學(xué)差

7、異(P＜0.05)。ELISA結(jié)果分析顯示pcDNA6.0-TNFR2196ARG組細(xì)胞上清液sTNFR2、IL-1β、IL-6的水平較pcDNA6.0-TNFR2196MET下調(diào)(P＜0.05)。與空白對照組和空質(zhì)粒組比較，pcDNA6.0-TNFR2196MET和pcDNA6.0-TNFR2196ARG兩組細(xì)胞抗凋亡和前炎癥因子TNFR2、cIAP1、cIAP2、IL-1β、IL-6、NF-κB和p-JNK的表達(dá)增高(P＜0.05)

8、。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建pcDNA6.0-TNFR2196MET、pcDNA6.0-TNFR2196ARG真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　 2.TNFR2196ARG突變體引起抗凋亡和前炎癥因子TNFR2、cIAP1、cIAP2、IL-1β、IL-6、p-JNK、NF-κB的表達(dá)較野生型下降，TNFR2196ARG通過TNF/TNFR信號通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，可能是冠心病慢性炎癥的分