人成骨肉瘤耐甲氨蝶呤細(xì)胞株建立及耐藥機(jī)制的探討.pdf

1、目的：建立人成骨肉瘤耐甲氨蝶呤細(xì)胞系，對(duì)其生物學(xué)特性及其耐藥機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法: 以甲氨喋呤藥物（methotrexate，MTX）為誘導(dǎo)劑，采用沖擊法逐步增加劑量誘導(dǎo)人成骨肉瘤原代細(xì)胞系（Saos-2），建立耐甲氨喋呤細(xì)胞系(Saos-2/MTX4.4)；MTT檢測(cè)耐藥細(xì)胞株對(duì) MTX、順鉑（Cisplatin,DDP）、阿霉素（doxorubicin，ADM）、異環(huán)磷酰胺（Ifosfamide，IFO）、表柔比星（Ep

2、irubicine，EPI）、比柔比星（Pirarubicin，THP）、紫杉醇（Paclitaxel，TAX）耐藥敏感性；計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥指數(shù)，細(xì)胞抑制率＝（1-耐藥組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值）×100％，計(jì)算耐藥指數(shù)= IC50（Saos-2/MTX4.4/ IC50（Saos-2）；利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞一般形態(tài)的變化，透射電鏡觀察細(xì)胞系超微結(jié)構(gòu)變化；計(jì)數(shù)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)目變化，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢

3、測(cè)細(xì)胞增殖能力；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同細(xì)胞系細(xì)胞周期比例變化，檢測(cè)不同耐藥系細(xì)胞增殖能力；用RT-PCR方法檢測(cè)不同細(xì)胞系還原性葉酸載體（reduced folate carrier ， RFC）基因的mRNA的表達(dá)，半定量對(duì)比測(cè)定不同細(xì)胞系的RFC基因mRNA表達(dá)；用液閃液儀檢測(cè)在含一定濃度3H-MTX培養(yǎng)液里不同時(shí)間進(jìn)入Saos-2與Saos-2/MTX4.4細(xì)胞系內(nèi)的藥物濃度，檢測(cè)不同細(xì)胞系的RFC基因的功能，初步探討細(xì)胞產(chǎn)生耐藥

4、的機(jī)制。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)27周的誘導(dǎo)，建立不同藥物濃度沖擊誘導(dǎo)的人骨肉瘤耐MTX細(xì)胞系（Saos-2/MTX1.0、 Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4），并對(duì)Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4細(xì)胞系與原代細(xì)胞系進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)；光鏡下觀察Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4細(xì)胞系表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，胞漿更豐富，多角形及多核細(xì)胞數(shù)量較原代Saos-2細(xì)胞系明顯增多；透射電鏡顯示S

5、aos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4細(xì)胞株表面突起較原代Saos-2細(xì)胞株減少、且核仁增大；細(xì)胞生長(zhǎng)曲線形態(tài)顯示耐藥細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線斜率較原代細(xì)胞減小，生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞系S期細(xì)胞所占比例減少，表明耐藥系增殖能力下降。MTT檢測(cè)結(jié)果表明，Saos-2細(xì)胞系對(duì)MTX的IC50為25.78±0.29 ng/ml，Saos-2/MTX2.2對(duì)MTX的IC50為125.56±0.24 ng/ml；S

6、aos-2/MTX4.4對(duì)MTX的IC50為328.24±0.29 ng/ml；其耐藥倍數(shù)分別為4.87和12.73；耐藥細(xì)胞株對(duì)ADM、EPI、THP、TAXOL亦產(chǎn)生不同程度的交叉耐藥，Saos-2與Saos-2/MTX4.4間IC50存在顯著差異（P<0.05）,而對(duì)DDP無(wú)明顯耐藥性(P>0.05)；用RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞系的RFC基因mRNA表達(dá)較原代細(xì)胞系Saos-2的RFC基因mRNA表達(dá)明顯下降，耐藥細(xì)胞

7、系Saos-2/MTX2.2和Saos-2/MTX4.4的RFC基因mRNA是原代的24.45和31.70倍；用液閃液儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在含3H-MTX培養(yǎng)液培養(yǎng)不同細(xì)胞系，進(jìn)入細(xì)胞的達(dá)峰時(shí)間均為30min，50min時(shí)細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度達(dá)平臺(tái)期，耐藥細(xì)胞系平臺(tái)期的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度是原代細(xì)胞系平臺(tái)期藥物濃度的2.15倍。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)建立了耐MTX人成骨肉細(xì)胞株Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTx4.4，并在基因水平探討的耐