表沒食子兒茶素沒食子酸酯對酒精性肝病小鼠鐵過載的作用和機制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是因長期、大量飲用各種含乙醇的飲料所致肝臟損害性病變,在組織病理學上主要表現(xiàn)為四種形式:酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化。ALD是全世界范圍內倍受關注的公共衛(wèi)生問題。ALD的發(fā)病機制復雜,涉及酒精及其代謝產(chǎn)物對肝臟的直接和間接損傷,同時還與營養(yǎng)狀態(tài)及遺傳易感性密切相關。大量證據(jù)表明,氧化應激在酒精性肝病的發(fā)病中起著重要作用,氧化

2、應激由產(chǎn)生過多的自由基(超氧化物,過氧化物,羥自由基)引起,可加速內在抗氧化劑(谷胱甘肽,維生素A、C和E)的消耗或兩者同時發(fā)生。幾種內源性自由基的來源,包括線粒體,黃嘌呤氧化酶,
　　 細胞色素P4502E1(CYP2E1),脂質加氧酶和Fe2+,已經(jīng)在慢性酒精攝入的動物肝臟中被證實。鐵通過催化超氧化物和過氧化氫轉變?yōu)楦鼜娪辛Φ难趸瘎?如羥自由基或高鐵自由基,或超高鐵自由基的Fenton反應而引起氧化應激。這些強有力的自由基.

3、通過脂質過氧化反應及蛋白和DNA氧化引起組織損傷。大量證據(jù)表明,鐵在酒精性肝病中起著重要作用。在慢性消耗的酒精依賴個體中,平均肝鐵濃度大量增加,而且在酒精性肝硬化的患者中,肝鐵攝取率增加。
　　 對ALD的治療目前尚缺乏特效手段,所用研究藥物因副作用大而不能廣泛應用于臨床,因此主要采用支持療法,予高蛋白、高維生素、低脂飲食,補充復合氨基酸、維生素類、微量元素鋅,維持電解質及液體平衡等及對癥治療。鐵是生物體內最重要的脂質過氧化反應

4、促進劑,鐵可啟動或催化Haber-weiss反應,產(chǎn)生自由基破壞肝細胞的細胞器(主要是對溶酶體膜的破壞),最終造成肝細胞死亡。而肝細胞的死亡又會進一步加重肝鐵過載,因為肝細胞壞死后,肝細胞漿內的鐵蛋白會被溶酶體消化,放出不溶性的含鐵血黃素,由此形成惡性循環(huán)。在這一過程中酒精和鐵對肝臟具有協(xié)同的損害作用。我們認為打破這個惡性循環(huán)的關鍵是改善或消除肝鐵過載。
　　 綠茶作為傳統(tǒng)飲料的代表有利于人體健康。茶多酚、兒茶素是綠茶的主要成分

5、,它是一種多酚化合物,主要的兒茶素包括表兒茶素(Ec)、沒食子酸表兒茶素(ECG)、表沒食子酸兒茶素(EGC)和沒食子酸表沒食子酸兒茶素(EGCG),其中EGCG含量最高,占兒茶素的50％左右。EGCG作為茶多酚的主要單體及活性成分,具有許多重要的生物功能,如抗氧化、抗炎、鐵螯合及抗癌等作用的發(fā)揮主要依賴于EGCG。研究表明EGCG對鐵超載引起的機體損傷表現(xiàn)出良好的保護作用,這種作用可能主要是通過以下兩個方面來完成的:①抗氧化；②螯合金

6、屬鐵離子。大量實驗證明,EGCG可以和鐵參與的氧化體系中的鐵離子發(fā)生作用,從而達到抑制氧化反應的產(chǎn)生。
　　 然而,關于茶多酚對酒精性肝病鐵代謝異常的作用目前國內外尚無報道。因此,本研究擬通過酒精灌胃建立ALD小鼠模型,以腹腔注射給予EGCG的方式,采取小鼠血清及肝組織標本,比較不同劑量EGCG作用下的小鼠肝臟病理變化、血清ALT,AST水平、血清鐵,肝鐵含量及肝組織SOD活性、MDA含量與模型組小鼠之間的差異,觀察其對ALD小

7、鼠模型的保護和治療作用,采用Real-timePCR、Western blot等方法研究EGCG對ALD小鼠肝臟鐵代謝相關因子HepcidinmRNA及Tf、TfR1蛋白表達的作用,從分子水平探討EGCG治療ALD鐵過載的作用機制。
　　 材料與方法:
　　 6～8周齡雄性SPF級C57BL6小鼠70只,體重21±2g。購回后飼養(yǎng)于恒溫,恒濕條件下自由攝取食水,飼養(yǎng)一周左右開始實驗。隨機分為正常組(12只)和模型組(58

8、只)。模型組小鼠每日予酒精灌胃,酒精劑量開始為4g/kg.d(溶液最大酒精含量為52％),計算方法為:酒精重量(g)=白酒體積(ml)×白酒酒精含量(v/v)×酒精密度(0.8/ml),5周內酒精劑量逐漸增加到6g/kg.d,持續(xù)該劑量繼續(xù)喂養(yǎng)7周。正常對照組小鼠以等體積生理鹽水灌胃。8周末取正常對照組,模型組動物各4只,剖殺,取血及肝臟組織,通過肝組織病理學及血清ALT、AST變化以確定模型建立是否成功。
　　 模型組小鼠于造

9、模第9周隨機分為5組,每組10只。即模型組；模型組+EGCG 10mg/kg組；模型組+EGCG 20mg/kg組；模型組+EGCG 30mg/kg組；模型組+去鐵胺200mg/kg組(陽性藥物組)。藥物均為腹腔注射給藥,正常對照組予等體積生理鹽水腹腔注射,每日一次,持續(xù)4周。實驗至第12周末,小鼠禁食24h,剖殺,留取血及肝組織備檢。血標本送檢珠江醫(yī)院檢驗科檢測血清ALT、AST及血清鐵含量。將取材后的肝組織固定于4％多聚甲醛溶液,石

10、蠟包埋,5μm切片行HE染色,光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)變化。另取肝組織制備10％組織勻漿,按試劑盒操作檢測肝組織蛋白含量、SOD活性及MDA含量。剩余肝組織置低溫冰箱-80℃冷凍保存,以Real-time PCR方法檢測Hepcidin mRNA表達水平,以Western blot印跡分析Tf和TfR1蛋白表達水平。
　　 結論:
　　 1.應用逐漸增加酒精濃度和劑量灌胃的方法可以成功制作小鼠ALD模型,該模型肝臟病變可

11、反映臨床酒精性肝病的基本病變。
　　 2.ALD發(fā)病過程中存在鐵過載,鐵過載參與了ALD的發(fā)病過程,Hepcidin mRNA表達水平的下調及Tf、TfR1蛋白表達水平失衡可能是促進病情進展的重要因素之一。
　　 3.EGCG顯著降低了脂質過氧化反應的終產(chǎn)物MDA的含量,提高了抗氧化劑SOD的活性,促使氧化與抗氧化機制恢復平衡,同時也降低了肝臟轉氨酶水平,使肝臟組織學明顯改善。
　　 4.EGCG對小鼠ALD鐵過