Bex2對(duì)人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化增殖影響的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建Bex2(brain expressed X-linked，Bex2)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，以觀察Bex2對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化增殖的影響，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法： 1.以Trizol一步法提取人腦膠質(zhì)細(xì)胞的總RNA為模板，采用RT-PCR法獲得Bex2的cDNA；用T載體連接后；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101進(jìn)行篩選、序列測(cè)定正確，雙酶切后將Bex2與質(zhì)粒pcDNA3.1(+)連接成

2、功。 2.取人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本制備單細(xì)胞懸液后，加入生長(zhǎng)因子EGF、bFGF和B27類似神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中克隆培養(yǎng)。待細(xì)胞懸浮形成腦腫瘤干細(xì)胞球時(shí)備用。 3.真核載體聯(lián)合脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的腫瘤干細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后18 h、36 h、48 h、72 h、96 h觀察基因Bex2在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的表達(dá)。 4.隨機(jī)化分三組：實(shí)驗(yàn)組，空載體組，空白對(duì)照組。5.各組均在干擾18 h、36 h、48 h、72 h、96

3、 h后收集細(xì)胞，MTT法檢測(cè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，用Hoechst染色試劑盒檢測(cè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡情況，用Western-blot檢測(cè)Bex2基因的表達(dá)。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建后天性沉默基因Bex2的真核表達(dá)載體； 2.基因Bex2在轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后18h即有表達(dá)，48h達(dá)到高峰，以后逐漸下降； 3.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染腫瘤干細(xì)胞36h、48 h、72h、96h時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯高于空

4、載體組和空白對(duì)照組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于同組的18 h、36 h、48 h和96 h(P<0.05)； 4.在應(yīng)用Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示，在轉(zhuǎn)染36h、48 h、72h、96h時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于空載體組和空白對(duì)照組(P<0.05)；72h時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率高于同組18h、36h、48h和96h(P<0.05)。 結(jié)論：Bex2能夠抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，促進(jìn)膠質(zhì)