第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞牙向分化差異基因的初步篩選.pdf

1、最新的發(fā)育生物學(xué)研究證實(shí)，在顱神經(jīng)嵴細(xì)胞分化形成牙頜骨器官的過程中，先后經(jīng)歷了顱神經(jīng)嵴→第一鰓弓外胚間充質(zhì)→牙頜骨外胚間充質(zhì)兩次關(guān)鍵性級聯(lián)分化。本研究旨在建立Balb/c胎小鼠第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行多向誘導(dǎo)分化研究，鑒定其干細(xì)胞生物學(xué)特性。同時(shí)，構(gòu)建第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞牙向分化雙向抑制消減文庫，初步篩選、驗(yàn)證、分析差異表達(dá)基因，為全面揭示牙發(fā)生、發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。 首先，精確解剖分離

2、孕9.5天(E9.5)Balb/c胎鼠第一鰓弓，采用組織塊法和改良酶消化法對其進(jìn)行原代培養(yǎng)，利用反復(fù)貼壁和多次差異消化法對其進(jìn)行純化，通過細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞生長曲線描記、計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間和特異性標(biāo)記物檢測對其細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行研究。其次，利用端粒酶原位雜交熒光探針和Brdu攝取實(shí)驗(yàn)，檢測第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和自我更新能力；取第3代細(xì)胞，更換不同的條件培養(yǎng)液，觀察其在成脂、成內(nèi)皮和礦化誘導(dǎo)液的刺激下，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并檢測鑒定相應(yīng)

3、的特異性細(xì)胞表型標(biāo)記，對細(xì)胞的可塑性進(jìn)行研究。然后，在相同的培養(yǎng)條件下，收取第3代第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞和E16.5下頜第一磨牙牙乳頭細(xì)胞，采用抑制消減雜交技術(shù)，構(gòu)建雙向抑制消減文庫，并對細(xì)胞的總RNA質(zhì)量、雙鏈cDNA酶切效果、接頭連接率、抑制消減效率、差異基因的富集程度和載體連接效率進(jìn)行全面質(zhì)控分析。最后，在雙向抑制消減文庫中隨機(jī)挑取23個(gè)白色克隆，測定其核苷酸序列，利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，對差異表達(dá)片段進(jìn)行同源性分析比較，尋找已知基

4、因和未知新基因，分析其相關(guān)功能研究進(jìn)展；解剖分離E9.5、E12.5、E14.5和E16.5胎鼠的第一鰓弓、下頜突和下頜第一磨牙牙乳頭，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，定量分析部分差異表達(dá)基因在四個(gè)時(shí)段組織學(xué)水平的相對變化趨勢。 研究結(jié)果表明：E9.5胎鼠額鼻突、第一鰓弓、第二鰓弓均界限清楚明確，便于準(zhǔn)確取材，組織塊法原代培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間約7～10天，上皮細(xì)胞成分較多，改良酶消化法原代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間約2～3天，上皮細(xì)胞成分較少，兩組細(xì)胞

5、傳代后細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長曲線、群體倍增時(shí)間無明顯差異，但采用改良酶消化法可以在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量充足、純度較高的滿足實(shí)驗(yàn)要求的細(xì)胞。特異性標(biāo)記物CD57/HNK1、波形絲蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈均一表達(dá)。第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞端粒酶原位雜交胞漿呈陽性反應(yīng)，BrdU孵育48小時(shí)，大部分細(xì)胞胞核呈陽性反應(yīng)。第3代外胚間充質(zhì)細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)1周左右，細(xì)胞內(nèi)可見連接成片的發(fā)亮的空泡，油紅O染色陽性，證實(shí)空泡為脂滴，RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳顯示，誘導(dǎo)后

6、細(xì)胞出現(xiàn)了脂蛋白脂肪酶的表達(dá)。成內(nèi)皮誘導(dǎo)10天左右，出現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞特有的鋪路石樣形態(tài)，馮威勒不蘭特因子免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈強(qiáng)陽性。礦化誘導(dǎo)1周后，Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性反應(yīng)，堿性磷酸酶染色大部分細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，礦化誘導(dǎo)2周后，茜素紅染色顯示細(xì)胞間出現(xiàn)致密的、圓形不透光團(tuán)塊，呈片狀紅染。以第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞為檢測子，建立的正向抑制消減文庫中共有184個(gè)白色克隆，以其為驅(qū)趕子建立的反向文庫中，共有132個(gè)白色克隆，通過多層次質(zhì)控分

7、析證實(shí)，消減文庫質(zhì)量可靠。對23個(gè)克隆進(jìn)行測序分析后發(fā)現(xiàn)有1個(gè)是空載體，去除重復(fù)序列，對15個(gè)差異片段進(jìn)行了同源性分析，發(fā)現(xiàn)有11個(gè)片段與小鼠已知基因高度同源，另有4個(gè)片段為染色體序列，可能為新基因。7個(gè)差異基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與抑制消減雜交技術(shù)所獲結(jié)論完全一致，其中克隆1-3倍比變化非常明顯，進(jìn)一步證明了其可能是一條新基因的推斷。 綜上所述，本研究首次在體外建立了E9.5胎鼠第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)模型，所培養(yǎng)第一鰓