抗LunX和EpCAM抗體腫瘤生物治療研究.pdf

1、惡性腫瘤是當今世界威脅人類健康和導致人類死亡的最嚴重疾病之一，如何有效治療惡性腫瘤已成為當務之急。近年來，隨著腫瘤發(fā)病機制從細胞水平到分子水平的進一步認識以及分子生物學技術的發(fā)展，分子靶向治療在臨床上取得了顯著的療效。研究癌癥發(fā)病的分子生物學機制，發(fā)現(xiàn)誘發(fā)癌變相關的特異性分子，再針對這些特異性的分子給予有力打擊，將會大大改善療效。單克隆抗體藥物憑其特異性高和毒性低已經成為分子靶向治療研究的熱點，臨床實踐表明單克隆抗體卓著的療效已經把腫瘤

2、的治療推向一個前所未有的新階段。
　　21世紀以來，抗體治療取得了突飛猛進的發(fā)展，已經成為血液瘤和實體瘤治療最成功和最重要的策略之一。目前，抗體殺傷腫瘤細胞的主要機制和策略包括:阻斷或激活腫瘤細胞生長或凋亡的信號傳導，活化免疫系統(tǒng)介導的腫瘤殺傷，偶聯(lián)功能效應分子靶向殺傷腫瘤細胞，靶向血管形成或腫瘤基質細胞。一個單克隆抗體進入臨床，需對其物理和化學等相關性質進行全面檢測和分析;具體地說，包括分析識別的抗原表達水平，發(fā)揮的免疫效應功能

3、和影響的信號通路，體內的分布、活性以及半衰期等。但是，決定一個單克隆抗體是否能夠成為臨床藥物的關鍵是其療效和安全性。
　　一個單克隆抗體的療效和安全性主要取決于其識別的抗原靶點，因此尋找合適的治療靶點成為抗體治療的主要挑戰(zhàn)和瓶頸。理想中的靶向抗原應該是高特異性，高豐度、明確的結構和功能信息等。
　　肺癌已經成為實體瘤中發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤之一。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)肺癌特異的治療靶點，因此急需尋找有效的肺癌治療靶點，

4、從而有利于肺癌的早期診斷以及靶向治療。肺特異X蛋白（LunX）屬于PLUNC家族，前期研究發(fā)現(xiàn)LunX mRNA可作為肺癌診斷的特異性生物標志物，而LunX蛋白與肺癌的相關性仍未報道。那么LunX蛋白是否廣泛表達于肺癌組織;是否促進肺癌的發(fā)生發(fā)展;是否可作為肺癌生物治療的靶標？于是圍繞上述三個問題開展靶向LunX治療肺癌的相關性研究。
　　血液瘤現(xiàn)如今已是兒童和青少年腫瘤的頭號殺手。上皮細胞粘附分子(EpCAM)是公認的惡性腫瘤相

5、關抗原，過表達于肺癌，肝癌，胃癌等惡性實體瘤中，但在大部分正常人上皮細胞中也處于低表達狀態(tài)。EpCAM已成為多種實體瘤臨床免疫治療的靶點(Munz，Baeuerle et al.2009)。目前，EpCAM及其抗體的臨床應用只局限于實體瘤，而其與白血病的相關性至今沒有通過大量臨床標本進行驗證;如果EpCAM過表達于白血病細胞，那么EpCAM可能也是白血病治療的新型靶點，其抗體也可作為白血病治療的潛在治療藥物。
　　本文主要從尋找肺

6、癌和血液瘤的治療靶點展開研究，獲得了如下結果:
　?、?、抗LunX抗體抑制非小細胞肺癌的生長及其轉移
　　本研究利用免疫組化技術分析150例肺癌病人的腫瘤組織和癌旁組織LunX蛋白表達水平;應用卡普蘭-邁耶曲線分析其中108例病人術后生存周期和LunX表達量的相關性;為了研究LunX與肺癌轉移的相關性，通過免疫熒光技術檢測83例肺癌病人新鮮引流淋巴結、鎖骨上淋巴結穿刺標本和胸水標本中侵襲腫瘤細胞LunX表達水平，以及通過Lu

7、nX RNA干擾和過表達技術，驗證LunX與腫瘤細胞的增殖和轉移的相關性。為了進一步研究LunX參與的信號通路，利用免疫共沉淀和免疫印跡技術尋找LunX作用的靶蛋白以及調控的信號通路。最后研制LunX治療性抗體，通過體外抗體抑制試驗以及體內肺癌移植模型小鼠驗證LunX抗體的功能。本研究通過上述研究方案取得了如下結果:
　　1.LunX表達于非小細胞肺癌
　　檢測肺癌病人的腫瘤組織LunX蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)LunX過表達于肺癌

8、組織并且陽性率達到90％，其中LunX蛋白表達越高的患者呈現(xiàn)更差的病理分期和更低的分化狀態(tài)，并且還發(fā)現(xiàn)LunX表達水平越高的病人呈現(xiàn)更低的生存率。此外，在多種肺癌細胞系中都可以檢測到LunX的廣泛表達。另外，在正常外周肺組織以及乳腺、肝臟、卵巢等其他器官中沒有檢測到LunX的表達。
　　2.LunX高表達于轉移的肺癌細胞
　　肺局部淋巴結和鎖骨上淋巴結中轉移的肺癌細胞全呈LunX陽性，并且，LunX表達越高的病人，其淋巴結轉

9、移的陽性率也越高。此結果提示LunX與肺癌的轉移相關。
　　3.LunX促進肺癌細胞的增殖及遷移
　　在不同LunX表達水平的肺癌細胞中，LunX表達水平高的肺癌細胞呈現(xiàn)更強的轉移能力。在A549和NCI-H292細胞中，干擾LunX能夠明顯抑制其增殖、遷移以及侵襲，過表達LunX，反之。
　　4.LunX通過活化14-3-3信號通路促進肺癌細胞的增殖及遷移
　　在肺癌細胞中，LunX直接作用于14-3-3蛋白，

10、并且通過阻斷14-3-3的磷酸化促進其形成活化狀態(tài)的同源或異源二聚體，進而活化下游的Erk1/2和JNK信號通路，最終導致腫瘤細胞的增殖和轉移。
　　5.靶向LunX小干擾RNA抑制肺癌的生長和轉移
　　在人肺癌原位，皮下瘤以及轉移的小鼠模型中，靶向LunX能夠抑制原位腫瘤的生長，局部侵襲、遠端克隆病灶形成以及遠端腫瘤病灶的生長;提示LunX可作為肺癌有效的治療靶點。
　　6.LunX抗體在體外能夠通過抗原抗體的內吞和

11、降解抑制肺癌細胞的增殖及遷移
　　基于肺癌細胞過表達LunX， LunX蛋白存在于細胞膜表面以及LunX促進肺癌的生長和轉移，于是制備和篩選了LunX抗體(S-35-8)，發(fā)現(xiàn)LunX抗體抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。LunX抗體的主要抗腫瘤機制是介導LunX蛋白的內吞及降解，進而抑制LunX下游信號通路。
　　7.LunX抗體在肺癌模型小鼠中抑制腫瘤的生長及轉移
　　LunX抗體能夠明顯抑制腫瘤的生長和轉移，并呈現(xiàn)劑量依

12、賴性。LunX抗體處理正常小鼠沒有出現(xiàn)明顯的組織炎癥和病理性特征。因此，初步結果顯示該抗體在體內毒性較小，為后續(xù)抗體的人源化和治療奠定了基礎。
　　綜上所述，基于上述LunX蛋白的表達特異性和其促進腫瘤生長與轉移的致癌機理，以及LunX體內沉默后的腫瘤抑制以及阻斷性抗體的治療作用，可初步確認LunX作為肺癌治療的新靶標。該研究中的人源化治療性抗體有可能對肺癌臨床治療具有重要意義。
　　Ⅱ、抗EpCAM抗體抑制髓系血液瘤的形成

13、
　　本研究利用流式細胞術檢測各種類型血液瘤患者的骨髓和外周血標本中EpCAM的表達，以及患者化療前后EpCAM陽性細胞的比例的變化。另外還通過體內外的克隆形成和成瘤實驗，驗證EpCAM是否參與血液瘤的形成。制備EpCAM治療性抗體，并驗證其體內抗腫瘤的效應以及機制。獲得的結果如下:
　　1.EpCAM表達于髓系白血病和多發(fā)性骨髓瘤細胞
　　在髓系細胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤病人的骨髓標本和外周血標本中檢測到EpCAM的表

14、達，而在正常人的骨髓和外周血標本中沒有檢測到EpCAM的表達。另外，髓系來源的白血病細胞系也呈EpCAM陽性。
　　2.EpCAM+白血病細胞具有更強的化療藥物耐藥性
　　在化療前后的同一病人標本中，EpCAM+細胞占異常細胞的比例在化療后明顯升高，并且EpCAM-細胞比EpCAM+細胞對化療藥更敏感。提示EpCAM促進白血病細胞的耐化療作用。
　　3.EpCAM抗體抑制白血病腫瘤病灶的形成
　　在K562和HL

15、60皮下瘤模型中，EpCAM抗體能夠抑制腫瘤的生長，當抗體濃度遞增到80mg/kg（小鼠每千克體重）時，腫瘤病灶能夠完全被清除。在尾靜脈接種的移植瘤小鼠模型中， EpCAM抗體治療能夠抑制腫瘤在頸部淋巴結和骨髓等部位的形成，并且外周血中的腫瘤細胞數(shù)也明顯減少。該模型中，抗體能明顯延長小鼠的生存周期。
　　4.Macrophage介導抗抗EpCAM抗體的抗腫瘤作用
　　EpCAM抗體的治療促進了脾臟F/80+Gr-1-的巨噬細