雙靶點(diǎn)survivin-siRNA、XIAP-siRNA對(duì)卵巢癌A2780-s細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：卵巢癌（OvarianCancer，OC）是女性生殖器官常見(jiàn)的腫瘤之一，雖然發(fā)病率次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位，但它是死亡率最高的婦科腫瘤，患病初期癥狀隱匿，造成確診時(shí)60-70％的卵巢惡性腫瘤患者已至晚期，常規(guī)的手術(shù)和內(nèi)分泌及化學(xué)療法均無(wú)法扭轉(zhuǎn)這些患者的生存期，尋找新的治療卵巢癌的方法迫在眉睫。近年來(lái)，人們對(duì)腫瘤的研究逐步向分子領(lǐng)域蔓延，以期通過(guò)基因治療達(dá)到治愈腫瘤的目的；細(xì)胞凋亡調(diào)控的紊亂是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要

2、環(huán)節(jié)，其中凋亡抑制蛋白家族（Inhibitorofapoptosisproteins，IAPs）是近些年來(lái)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。并且研究發(fā)現(xiàn)：與卵巢癌有關(guān)的IAPs主要XIAP、survivin和CIAP2。目前，有關(guān)siRNA沉默survivin基因和XIAP基因?qū)β殉舶〢2780-s細(xì)胞凋亡作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中旨在探討：（1）survivin，XIAP基因分別在A2780-s細(xì)胞中的作用（2）雙靶點(diǎn)surviving-siRNA

3、、XIAP-siRNA對(duì)卵巢癌A2780-s細(xì)胞凋亡的影響。（3）survivin，XIAP之間的相互作用，以期達(dá)到為卵巢癌的治療提供新靶點(diǎn)。
　　 方法：研究對(duì)象為人卵巢癌細(xì)胞系（A2780-s）。（1）設(shè)計(jì)并且構(gòu)建針對(duì)survivin和XIAP化學(xué)合成的siRNA；用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)卵巢癌A2780-s細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)空白對(duì)照組（Blank組）、雙轉(zhuǎn)染組（Survivin-siRNA與XIAP

4、-siRNA）半量混合轉(zhuǎn)染、單轉(zhuǎn)Survivin-siRNA、單轉(zhuǎn)XIAP-siRNA、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組（Mock）；（2）通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)Survivin、XIAP蛋白在轉(zhuǎn)染48h后的蛋白表達(dá)情況；（3）PI染色觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞的凋亡情況；（4）通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡率；（5）MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。
　　 結(jié)果：（1）成功培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株；（2）w

5、esternblot結(jié)果證實(shí)survivin和XIAP蛋白在卵巢癌細(xì)胞A2780-s中有表達(dá)，并且單、雙轉(zhuǎn)染組的蛋白表達(dá)明顯受到抑制，單轉(zhuǎn)染survivin-siRNA組、單轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組、雙轉(zhuǎn)染組的蛋白表達(dá)量分別是0.35、0.32、0.21（P<0.05），而空白對(duì)照組、Mock組分別是1.00、0.89（P>0.05），對(duì)照組的蛋白表達(dá)量均高于轉(zhuǎn)染組；（3）PI染色結(jié)果顯示細(xì)胞調(diào)亡形態(tài)學(xué)變化，圖示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明顯減少，雙

6、轉(zhuǎn)染組尤為顯著，可見(jiàn)細(xì)胞核固縮，碎片，體積變小及凋亡小體形成，共轉(zhuǎn)染組較其單轉(zhuǎn)組結(jié)果更為明顯，藥物組細(xì)胞也相對(duì)減少，但是相對(duì)雙轉(zhuǎn)組細(xì)胞稍多；（4）通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀測(cè)得各組細(xì)胞的凋亡率，雙轉(zhuǎn)染組、單轉(zhuǎn)Survivin-siRNA、單轉(zhuǎn)XIAP-siRNA的凋亡率分別為29.67％、18.82％、19.18％（P<0.05）；空白對(duì)照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組凋亡率分別為：1.35％，4.51％（P>0.05）無(wú)明顯

7、的差異，且轉(zhuǎn)染組均高于對(duì)照組；（5）MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞的增值情況。雙轉(zhuǎn)染組、單轉(zhuǎn)survivin-siRNA組、單轉(zhuǎn)XIAP-siRNA組細(xì)胞的存活率分別為49％±0.56、58％±0.46、54％±0.37，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的存活率均低于對(duì)照組，而雙轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的存活率明顯低于單轉(zhuǎn)組（P<0.05）。
　　 結(jié)論：（1）Survivin、XIAP基因在卵巢癌細(xì)胞株中有表達(dá)。（2）雙靶點(diǎn)survivin-siRNA、X