體外共培養(yǎng)條件下定向誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向人前交叉韌帶成纖維細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1）探討人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）是否具有MSCs的特性及純度。
　　2）比較膠原酶消化法與原位組織塊培養(yǎng)法對(duì)分離人前交叉韌帶成纖維細(xì)胞（human anterior cruciate ligament fibroblasts，hACLFs）的效果；探討使用堿性成纖維生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)G

2、F）作用于人前交叉韌帶成纖維細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、增殖及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的效應(yīng)。
　　3）探討體外聯(lián)合生長(zhǎng)因子行單純誘導(dǎo)、單層共培養(yǎng)及Transwell共培養(yǎng)定向誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向人前交叉韌帶成纖維細(xì)胞分化的效果。
　　方法：
　　1）取產(chǎn)婦胎盤(pán)用胰酶-膠原酶聯(lián)合消化法分離獲得hAMSCs。流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定hAMSCs表型分子，CCK-8法檢測(cè)hAMSCs增殖活性，免疫熒光染色檢測(cè)第3代hAMSCs的CK-1

3、9和波形蛋白表達(dá)。分別使用茜素紅、甲苯胺藍(lán)及油紅O染色法檢測(cè)7d和21d時(shí)hAMSCs向成骨、成軟骨及成脂細(xì)胞分化后的效果。對(duì)成骨細(xì)胞行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)向成骨、成軟骨及成脂細(xì)胞誘導(dǎo)7d、21d時(shí)相關(guān)基因表達(dá)水平。
　　2）分別使用膠原酶消化法和組織塊原位培養(yǎng)法分離hACLFs，倒置相差顯微鏡觀察兩種方法分離的細(xì)胞形態(tài)，CCK-8法檢測(cè)兩種分離方法細(xì)胞增殖

4、能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hACLFs細(xì)胞表型；使用bFGF培養(yǎng)第3代hACLFs后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，分別在第7d、10d及14d時(shí)行免疫熒光染色觀察細(xì)胞I、III型膠原，纖維連接蛋白（Fibronectin）及細(xì)胞連接素（Tenascin-C）的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）檢測(cè)韌帶相關(guān)基因及蛋白水平改變。
　　3）聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(trans

5、forming growth factor-β，TGF-β1）和bFGF作為誘導(dǎo)劑置于LG-DMEM/F12培養(yǎng)基中。使用第3代hAMSCs和hACLFs，按照單純誘導(dǎo)、單層共培養(yǎng)及Transwell共培養(yǎng)進(jìn)行分組：?jiǎn)渭冋T導(dǎo)組（A組）、單純非誘導(dǎo)組（B組）、單層共培養(yǎng)誘導(dǎo)組（C組）、單層共培養(yǎng)非誘導(dǎo)組（D組）、Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組（E組）及Transwell共培養(yǎng)非誘導(dǎo)組（F組）。共培養(yǎng)組兩種細(xì)胞密度調(diào)整為104/ml比例為1

6、:1，其中C、D兩組中的hACLFs在共培養(yǎng)前24h內(nèi)使用Arab-C（終濃度為5μg/ml）以特異性殺滅處于S期的成纖維細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)。CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性，分別于7d、14d和21d時(shí)：免疫熒光染色觀察各組細(xì)胞I、III型膠原，F(xiàn)ibronectin及Tenascin-C的表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組韌帶相關(guān)基因表達(dá)水平，苦味酸天狼猩紅染色法觀察各組細(xì)胞總膠原表達(dá)，Western blo

7、t檢測(cè)各組細(xì)胞中韌帶相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1）胰酶-膠原酶聯(lián)合消化法可獲得大量可穩(wěn)定增殖的hAMSCs。流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果表明hAMSCs表達(dá)MSCs表型。第3代hAMSCs高表達(dá)波形蛋白，低表達(dá)CK-19。茜素紅染色顯示，成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞存在多個(gè)礦化結(jié)節(jié)，細(xì)胞中堿性磷酸酶活性明顯增加；甲苯胺藍(lán)染色顯示，成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞基質(zhì)中分泌大量的糖胺聚糖；油紅O染色顯示，成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂滴。實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果顯示，

8、成骨、成軟骨及成脂誘導(dǎo)21d后，相關(guān)基因表達(dá)較7d時(shí)明顯增高（P<0.05）。
　　2）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示體外分離的hACLFs表達(dá)成纖維細(xì)胞相關(guān)表型分子。使用兩種分離方法分離的細(xì)胞形態(tài)學(xué)在傳至第2代時(shí)發(fā)生改變，組織塊原位培養(yǎng)法分離的細(xì)胞數(shù)量更多，呈長(zhǎng)梭形、雙極樣生長(zhǎng)，形態(tài)更加趨近于成纖維細(xì)胞，膠原酶消化法分離的細(xì)胞數(shù)量較少，呈短棒、不規(guī)則狀。組織塊原位培養(yǎng)法分離的hACLFs增殖能力顯著高于膠原酶消化法（P<0.05）。bFGF

9、作用于第3代hACLFs后，細(xì)胞增殖能力顯著提高（P<0.05），細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、成纖維樣生長(zhǎng)且極性明顯。免疫熒光染色顯示使用bFGF培養(yǎng)的細(xì)胞其I、III型膠原，F(xiàn)ibeonectin和Tenascin-C表達(dá)有顯著提高；PCR結(jié)果顯示bFGF培養(yǎng)組中I、III型膠原、Fibronectin、Tenascin-C，基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、賴氨酰氧化酶-1（lysyl oxi

10、dase-1，LOX-1）的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示加入 bFGF培養(yǎng)的hACLFs其 I、III型膠原蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。
　　3）使用誘導(dǎo)因子的各組其細(xì)胞增殖水平顯著高于未使用誘導(dǎo)因子組（P<0.05）。免疫熒光染色顯示I、III型膠原，F(xiàn)ibeonectin和Tenascin-C表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，使用誘導(dǎo)因子各組蛋白表達(dá)水平高于非誘導(dǎo)組，其中T

11、ranswell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組于21d時(shí)蛋白表達(dá)較其他組更高。PCR結(jié)果顯示I、III型膠原、Fibronectin、Tenascin-C， MMP-2、LOX-1、α-肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的mRNA表達(dá)水平于14d和21d時(shí)顯著上調(diào)（P<0.05），Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組于21d時(shí)，I、III型膠原、MMP-2、LOX-1、α-SMA其表達(dá)高于其他組。Western blot結(jié)果顯示

12、Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組于21d時(shí)I、III型膠原蛋白表達(dá)水平顯著高于其他組（P<0.05）?？辔端崽炖切杉t染色結(jié)果顯示21d時(shí)Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組總膠原水平最高，較其他組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1) 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有MSCs的特征并且可以向成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的潛能，可選作為組織工程學(xué)的種子細(xì)胞。
　　2）體外成功分離hACLFs，并表達(dá)成纖維細(xì)胞的表型分子；證實(shí)

13、組織塊原位培養(yǎng)法分離的細(xì)胞增殖效率更高,獲得細(xì)胞數(shù)量更多，形態(tài)學(xué)更趨近于成纖維細(xì)胞。
　　3）bFGF可提高h(yuǎn)ACLFs體外增殖能力,細(xì)胞形態(tài)更趨向成纖維細(xì)胞特性,韌帶相關(guān)特異性基因及蛋白表達(dá)增加。
　　4）bFGF聯(lián)合TGFβ-1可促進(jìn)hAMSCs向hACLFS分化；單層共培養(yǎng)與Transwell共培養(yǎng)較單純誘導(dǎo)方法,細(xì)胞分化效果更加明顯；在基因、蛋白及膠原分泌水平上, Transwell共培養(yǎng)方式比單層共培養(yǎng)誘導(dǎo)效果更強(qiáng)