ERK5信號通路在吸煙暴露誘導的腎癌細胞上皮間質轉化中的作用研究.pdf

1、背景與研究目的：
　　腎癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)生率排名居人類惡性腫瘤第十四位。它起源于腎小管上皮細胞，以透明細胞癌最常見，占腎細胞癌的70%-80%，另外還有乳頭狀癌、嫌色細胞癌等。目前腎癌病因尚未明確，有資料顯示其發(fā)病與吸煙、解熱鎮(zhèn)痛藥、激素、病毒、咖啡鎘等有關。其中吸煙是已知最明確的危險因素，據推測20%-30%的男性和10%-20%的女性腎癌的發(fā)生是由吸煙引起。我國是世界上最大的煙草生產和消費國，吸煙引發(fā)的腫瘤及

2、相關疾病，已成為國民健康的嚴重威脅。上皮間質轉化在細胞惡轉及腫瘤轉移過程中起到至關重要的作用。本課題通過體外實驗研究吸煙暴露對人腎癌細胞上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影響，并探討ERK5信號通路在吸煙暴露誘導腎癌細胞的EMT中的作用。
　　方法：
　　建立體外細胞吸煙處理模型；MTT法篩選對腎癌細胞ACHN、A498細胞活力無明顯影響的香煙懸液（cigarette

3、 smoking extract，CSE）濃度，后根據篩選結果選擇相應濃度 CSE處理腎癌細胞。
　?。?）通過顯微鏡觀察CSE對腎癌細胞形態(tài)的影響并記錄；
　?。?）通過 transwell實驗、劃痕實驗觀察CSE能否引起腎癌細胞侵襲、轉移能力改變；
　?。?）運用 western blotting、免疫熒光檢測上皮間質轉化相關分子標志物的變化；qRT-PCR方法檢測CSE對腎癌細胞上皮間質轉化相關標志物mRNA表達

4、水平的影響；
　?。?）用western blotting檢測吸煙處理對腎癌細胞ERK5通路及AP-1通路活性的影響；
　?。?）ERK5通路特異性抑制劑XMD8-92處理細胞，檢測其對吸煙誘導的腎癌細胞ACHN、A498上皮間質轉化的干預效果。
　　結果：
　?。?）通過MTT法篩選適宜濃度的CSE作為實驗濃度（0%、0.1%、0.25%、0.5%），當CSE濃度在0.75%及以上時，細胞活力明顯受到影響，并具

5、有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；
　　（2）CSE處理腎癌細胞6天后，鏡下觀察細胞由原來的聚集變的更為分散，形態(tài)由原來的扁橢圓形變?yōu)殚L梭形，部分細胞伸出偽足；劃痕實驗、transwell實驗表明，經 CSE處理后腎癌細胞轉移侵襲能力明顯增強。
　?。?）western blotting、免疫熒光檢測發(fā)現腎癌細胞經CSE處理后，上皮標志物E-Cadherin、ZO-1表達水平呈上調趨勢，間質標志物vimentin、N-cadhe

6、rin表達水平呈下調趨勢；同時，經qRT-PCR證實，上述相關標志物的mRNA表達水平亦表現相同的變化趨勢。
　　（4）通過western blotting檢測發(fā)現，磷酸化ERK5(phosphorylated ERK5,P-ERK5)水平呈明顯上升趨勢，而總 ERK5(total ERK5,T-ERK5)呈明顯下降趨勢；AP-1通路中磷酸化c-jun（phosphorylated c-jun，p-c-jun）、磷酸化c-fos（

7、phosphorylated c-fos，p-c-fos）表達水平呈上升趨勢?？梢?，吸煙處理可激活ERK5通路。
　　（5）ERK5通路特異性抑制劑 XMD8-92可逆轉吸煙誘導的腎癌細胞上皮間質轉化過程，表現如下：細胞形態(tài)上，由間質表型向上皮表型轉變，且細胞重新表現相互聚集狀態(tài)；劃痕實驗及transwell實驗見細胞轉移侵襲能力出現逆轉；EMT相關標志物，上皮標志物E-cadherin、ZO-1表達水平上升，而間質標志物間質標志