ERK5信號(hào)通路在吸煙暴露誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究.pdf_第1頁(yè)
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1、背景與研究目的:
  腎癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,發(fā)生率排名居人類惡性腫瘤第十四位。它起源于腎小管上皮細(xì)胞,以透明細(xì)胞癌最常見(jiàn),占腎細(xì)胞癌的70%-80%,另外還有乳頭狀癌、嫌色細(xì)胞癌等。目前腎癌病因尚未明確,有資料顯示其發(fā)病與吸煙、解熱鎮(zhèn)痛藥、激素、病毒、咖啡鎘等有關(guān)。其中吸煙是已知最明確的危險(xiǎn)因素,據(jù)推測(cè)20%-30%的男性和10%-20%的女性腎癌的發(fā)生是由吸煙引起。我國(guó)是世界上最大的煙草生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó),吸煙引發(fā)的腫瘤及

2、相關(guān)疾病,已成為國(guó)民健康的嚴(yán)重威脅。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在細(xì)胞惡轉(zhuǎn)及腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。本課題通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究吸煙暴露對(duì)人腎癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影響,并探討ERK5信號(hào)通路在吸煙暴露誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的EMT中的作用。
  方法:
  建立體外細(xì)胞吸煙處理模型;MTT法篩選對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN、A498細(xì)胞活力無(wú)明顯影響的香煙懸液(cigarette

3、 smoking extract,CSE)濃度,后根據(jù)篩選結(jié)果選擇相應(yīng)濃度 CSE處理腎癌細(xì)胞。
 ?。?)通過(guò)顯微鏡觀察CSE對(duì)腎癌細(xì)胞形態(tài)的影響并記錄;
 ?。?)通過(guò) transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)觀察CSE能否引起腎癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力改變;
  (3)運(yùn)用 western blotting、免疫熒光檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子標(biāo)志物的變化;qRT-PCR方法檢測(cè)CSE對(duì)腎癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)

4、水平的影響;
 ?。?)用western blotting檢測(cè)吸煙處理對(duì)腎癌細(xì)胞ERK5通路及AP-1通路活性的影響;
  (5)ERK5通路特異性抑制劑XMD8-92處理細(xì)胞,檢測(cè)其對(duì)吸煙誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞ACHN、A498上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的干預(yù)效果。
  結(jié)果:
  (1)通過(guò)MTT法篩選適宜濃度的CSE作為實(shí)驗(yàn)濃度(0%、0.1%、0.25%、0.5%),當(dāng)CSE濃度在0.75%及以上時(shí),細(xì)胞活力明顯受到影響,并具

5、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);
  (2)CSE處理腎癌細(xì)胞6天后,鏡下觀察細(xì)胞由原來(lái)的聚集變的更為分散,形態(tài)由原來(lái)的扁橢圓形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,部分細(xì)胞伸出偽足;劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng) CSE處理后腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力明顯增強(qiáng)。
 ?。?)western blotting、免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞經(jīng)CSE處理后,上皮標(biāo)志物E-Cadherin、ZO-1表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢(shì),間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、N-cadhe

6、rin表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢(shì);同時(shí),經(jīng)qRT-PCR證實(shí),上述相關(guān)標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平亦表現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。
 ?。?)通過(guò)western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),磷酸化ERK5(phosphorylated ERK5,P-ERK5)水平呈明顯上升趨勢(shì),而總 ERK5(total ERK5,T-ERK5)呈明顯下降趨勢(shì);AP-1通路中磷酸化c-jun(phosphorylated c-jun,p-c-jun)、磷酸化c-fos(

7、phosphorylated c-fos,p-c-fos)表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)??梢?jiàn),吸煙處理可激活ERK5通路。
 ?。?)ERK5通路特異性抑制劑 XMD8-92可逆轉(zhuǎn)吸煙誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程,表現(xiàn)如下:細(xì)胞形態(tài)上,由間質(zhì)表型向上皮表型轉(zhuǎn)變,且細(xì)胞重新表現(xiàn)相互聚集狀態(tài);劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)見(jiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力出現(xiàn)逆轉(zhuǎn);EMT相關(guān)標(biāo)志物,上皮標(biāo)志物E-cadherin、ZO-1表達(dá)水平上升,而間質(zhì)標(biāo)志物間質(zhì)標(biāo)志

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