ERK5信號通路在吸煙暴露誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究.pdf

1、背景與研究目的：
　　腎癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)生率排名居人類惡性腫瘤第十四位。它起源于腎小管上皮細(xì)胞，以透明細(xì)胞癌最常見，占腎細(xì)胞癌的70%-80%，另外還有乳頭狀癌、嫌色細(xì)胞癌等。目前腎癌病因尚未明確，有資料顯示其發(fā)病與吸煙、解熱鎮(zhèn)痛藥、激素、病毒、咖啡鎘等有關(guān)。其中吸煙是已知最明確的危險因素，據(jù)推測20%-30%的男性和10%-20%的女性腎癌的發(fā)生是由吸煙引起。我國是世界上最大的煙草生產(chǎn)和消費(fèi)國，吸煙引發(fā)的腫瘤及

2、相關(guān)疾病，已成為國民健康的嚴(yán)重威脅。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在細(xì)胞惡轉(zhuǎn)及腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起到至關(guān)重要的作用。本課題通過體外實驗研究吸煙暴露對人腎癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影響，并探討ERK5信號通路在吸煙暴露誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的EMT中的作用。
　　方法：
　　建立體外細(xì)胞吸煙處理模型；MTT法篩選對腎癌細(xì)胞ACHN、A498細(xì)胞活力無明顯影響的香煙懸液（cigarette

3、 smoking extract，CSE）濃度，后根據(jù)篩選結(jié)果選擇相應(yīng)濃度 CSE處理腎癌細(xì)胞。
　?。?）通過顯微鏡觀察CSE對腎癌細(xì)胞形態(tài)的影響并記錄；
　?。?）通過 transwell實驗、劃痕實驗觀察CSE能否引起腎癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力改變；
　?。?）運(yùn)用 western blotting、免疫熒光檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子標(biāo)志物的變化；qRT-PCR方法檢測CSE對腎癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)

4、水平的影響；
　　（4）用western blotting檢測吸煙處理對腎癌細(xì)胞ERK5通路及AP-1通路活性的影響；
　?。?）ERK5通路特異性抑制劑XMD8-92處理細(xì)胞，檢測其對吸煙誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞ACHN、A498上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的干預(yù)效果。
　　結(jié)果：
　?。?）通過MTT法篩選適宜濃度的CSE作為實驗濃度（0%、0.1%、0.25%、0.5%），當(dāng)CSE濃度在0.75%及以上時，細(xì)胞活力明顯受到影響，并具

5、有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；
　?。?）CSE處理腎癌細(xì)胞6天后，鏡下觀察細(xì)胞由原來的聚集變的更為分散，形態(tài)由原來的扁橢圓形變?yōu)殚L梭形，部分細(xì)胞伸出偽足；劃痕實驗、transwell實驗表明，經(jīng) CSE處理后腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　?。?）western blotting、免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞經(jīng)CSE處理后，上皮標(biāo)志物E-Cadherin、ZO-1表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、N-cadhe

6、rin表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢；同時，經(jīng)qRT-PCR證實，上述相關(guān)標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平亦表現(xiàn)相同的變化趨勢。
　?。?）通過western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，磷酸化ERK5(phosphorylated ERK5,P-ERK5)水平呈明顯上升趨勢，而總 ERK5(total ERK5,T-ERK5)呈明顯下降趨勢；AP-1通路中磷酸化c-jun（phosphorylated c-jun，p-c-jun）、磷酸化c-fos（

7、phosphorylated c-fos，p-c-fos）表達(dá)水平呈上升趨勢?？梢?，吸煙處理可激活ERK5通路。
　　（5）ERK5通路特異性抑制劑 XMD8-92可逆轉(zhuǎn)吸煙誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，表現(xiàn)如下：細(xì)胞形態(tài)上，由間質(zhì)表型向上皮表型轉(zhuǎn)變，且細(xì)胞重新表現(xiàn)相互聚集狀態(tài)；劃痕實驗及transwell實驗見細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)；EMT相關(guān)標(biāo)志物，上皮標(biāo)志物E-cadherin、ZO-1表達(dá)水平上升，而間質(zhì)標(biāo)志物間質(zhì)標(biāo)志